吳蔓莉， 李可欣， 侯爽爽， 許殷瑞， 王 麗， 王 娣， 郭西倩

1.西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院, 陜西 西安 710055 2.陜西省環(huán)境工程重點實驗室, 陜西 西安 710055 3.西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室， 陜西 西安 710055

利用生物強化和生物刺激技術修復石油污染土壤，具有經(jīng)濟、綠色、長效、無二次污染等優(yōu)點，是目前廣泛采用的土壤有機污染生物修復技術[1-3]. 生物強化是指向土壤中接種外源降解菌以對土壤中石油烴進行去除的方法[4]. 由于接種的降解菌可直接對目標污染物進行降解，因此具有針對性強、降解速度快、短期內即可對土壤中大部分石油烴進行有效去除等優(yōu)點[5-8]. 文獻報道的用于生物強化修復的石油烴降解菌主要有不動細菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、桿菌屬(Flavobacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、動膠菌屬(Zoogloea)、諾卡氏菌屬(Nocardia)等. 生物刺激是指在人工優(yōu)化的條件下通過引入營養(yǎng)物、H2O2、O2、NO3-等電子受體刺激土壤中土著微生物的生長以降解污染物的方法[9-11]. 土壤養(yǎng)分是限制微生物活性的影響因素，當土壤中C/N接近10∶1時，微生物活性最好且對污染物的降解能力最強[12-13]. 石油污染土壤中由于外碳源的大量輸入，土壤氮源相對不足，使土壤微生物活性受到抑制. 向土壤中補充氮素以提高土著微生物對石油烴的代謝活性是常用的石油污染修復方法[14-16]. 生物刺激修復具有費用低、對環(huán)境的影響小、對污染物降解快速等優(yōu)點. 但是對于實際污染場地的修復，外加氮素對土壤微生物的激活作用受當?shù)貧夂驐l件和土著菌群結構的影響較大，因此，需要通過前期修復預試驗，確定生物刺激修復對土壤中石油烴的去除效率.

陜北油氣開采區(qū)位于毛烏素沙地南緣與陜北黃土丘陵溝壑區(qū)接壤地帶，土壤類型主要為黃綿土，具有土體疏松、軟綿、土色淺淡等特點. 土壤中礦物鹽含量高，有機質含量低，土壤貧瘠，土著微生物種類和數(shù)量較少. 近些年來，受陜北油田開發(fā)的影響，土壤受石油污染嚴重，亟需得到有效治理.

針對陜北黃土高原區(qū)土壤修復需求，該研究以陜北延長地區(qū)石油污染土壤為研究對象，比較接種降解菌和外源氮生物刺激兩種方式對土壤中石油烴的去除效果，探究生物強化降解菌的生長存活特性與石油烴去除效率的關系，分析適合陜北污染土壤修復的氮源類型和最適C/N，以期為陜北油田區(qū)污染土壤的修復治理和生態(tài)環(huán)境恢復提供參考.

1 材料與方法

1.1 石油污染土壤的質地及理化性質

石油污染土壤采自陜北延長(109°33′E、36°14′N)某油井附近. 土壤經(jīng)碎散、除雜、過篩(0.85 mm)后混勻. 土壤中總石油烴含量為 15 233 mg/kg.

土壤樣品理化性質測定方法參考《土壤農化分析》[17]. 各指標測定方法和結果見表1.

表1 石油污染黃綿土的理化性質及土壤質地

1.2 石油烴降解菌群的篩選及鑒定

以石油污染土壤為降解菌的菌源，利用富集培養(yǎng)和平板劃線法分離篩選石油烴降解菌. 篩選的詳細過程：在無菌條件下將5 g石油污染土壤接種于50 mL滅菌的L9培養(yǎng)基〔Na2HPO4·12H2O 17.689 g，KH2PO43.0 g，NH4Cl 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.12 g，2.5 mL微量元素(MnCl2·2H2O 23 mg，MnCl4·H2O 30 mg，H3BO331 mg，CoCl2·6H2O 36 mg，CuCl2·2H2O 10 mg，NiCl2·6H2O 20 mg，Na2MoO4·2H2O 30 mg，ZnCl250 mg，1 L去離子水〕中，30 ℃、150 r/min條件下振蕩2 h. 靜置，無菌條件下移取5 mL上層液體至含1%原油(取自陜北某油田)的100 mL L9培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d. 如此轉接培養(yǎng)5次后，將最后一次的培養(yǎng)液在 10 000 r/min下離心分離，加入20 mL L9洗滌混合菌5次后，獲得石油烴降解菌群MC. 取5 mL MC送生工生物工程(上海)股份有限公司測序. 其余部分保存在甘油中置于冰箱-20 ℃ 保存.

1.3 石油污染土壤的修復試驗方案

1.3.1生物刺激修復中最佳氮源的篩選

稱取36份20 g土壤分裝于36個燒杯中，分別向污染土壤中加入尿素、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、NaNO35種不同類型的氮素，設置土壤C/N為100∶10(C含量以總石油烴含量的85.1%計)，以不加入氮素的土壤為控制試驗(CK)，設置土壤含水量分別為5.1%和15.1%. 每個處理設3個平行. 修復30 d時取樣進行測定，根據(jù)測定結果確定適合黃綿土修復的氮素類型.

1.3.2最佳C/N的確定

稱取12份20 g污染土壤分裝于12個燒杯中，利用1.3.1節(jié)試驗選出的最佳氮素類型，按C/N分別為100∶5、100∶10、100∶20向土壤中進行施加，以不施入氮素的土壤作為控制試驗(CK)，設置土壤含水量為15.1%，修復30 d時取樣測定，比較不同C/N對黃綿土中石油烴的去除效果.

1.3.3生物強化和生物刺激對污染土壤的修復效果比較

利用1.2節(jié)篩選出的MC菌群制備OD600=1.0的菌懸液〔制備方法：將保存在甘油中的MC在無菌條件下接種至50 mL滅菌的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，無菌水定容至1 L，pH=7.0)中〕，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，8 000 r/min下離心分離10 min，棄去上清液，使用20 mL滅菌的L9培養(yǎng)基洗滌，相同條件下離心分離，重復2次后，用PBS溶解獲得MC菌懸液. 將獲得的MC菌懸液的OD值調節(jié)為1.0(600 nm處測定)備用.

石油污染土壤的生物修復試驗方案見表2. 稱取18份500 g的污染土壤分裝于18個花盆中，室溫條件下分別向土壤中接種石油烴降解菌群MC，或者加入KNO3進行生物強化或生物刺激修復試驗. 每個處理設置3個平行.

表2 石油污染土壤的生物修復試驗方案

修復過程中每隔3～4 d翻動一次土壤，在第7、15、30、45、60天取樣測定土壤中總石油烴含量.

1.4 測定方法

1.4.1石油烴測定方法

采用超聲萃取提取土壤中的總石油烴并利用GC-FID測定[18]. 準確稱取風干土樣 3.000 g置于離心管中，加入正己烷和二氯甲烷(體積比為1∶1)的混合物15 mL，在超聲細胞破碎儀(JY92-Ⅱ，SONICS，美國)中超聲萃取10 min(萃取功率為170 W)，在4 ℃、8 000 r/min下離心15 min，用定量濾紙過濾后將提取液倒入已稱重的稱量瓶中，重復萃取2次. 將稱量瓶放于通風櫥，使提取劑揮發(fā)后加入二氯甲烷定容，采用GC-FID(PE CLARUS 680，PerkinElmer，美國)對石油烴含量進行測定.

GC-FID條件[19]：HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm). 進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度320 ℃；進樣量1 μL，無分流進樣；載氣N2流量1.5 mL/min；柱溫設置為40 ℃，保留1 min，以10 ℃/min的速率升至290 ℃，保留5 min，最后以30 ℃/min的速率升至320 ℃，保持1 min.

1.4.2土壤微生物多樣性及菌群結構的高通量測序

選擇5.1%土壤含水量條件下的8個土壤樣品進行高通量測序分析，即自然放置第60天(NCK)、接種降解菌強化修復第7天(NBA7)和第60天(NBA60)的土壤樣品、生物刺激修復第60天的土壤樣品(NBS60)；15.1%土壤含水量下放置第60天的樣品(ACK)、接種降解菌生物強化修復第7天(ABA7)和修復第60天(ABA60)、生物刺激修復第60天的土壤樣品(ABS60).

高通量測序分析主要步驟： ①利用OMEGA試劑盒(Omega Biotek Inc., USA)提取土壤樣品的總DNA，利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量. ②利用引物341F(5′-CCCTACACGACGCT CTTCCGATCTG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA-3′)進行第一輪PCR擴增，擴增程序參照文獻[20]；引入Illumina橋式PCR引物后，進行第二輪擴增. ③擴增結束后，對PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測，對于細菌的 PCR 產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物進行純化回收. 利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，最終上機測序濃度為20 pmol.

1.5 統(tǒng)計分析方法

對高通量測序結果進行處理及統(tǒng)計分析. 使用Prinseq軟件對高通量測序結果進行質量控制，將所測序列與RDP數(shù)據(jù)庫進行序列比對，使用Mothur軟件按97%的相似度歸類同種可操作分類單元(OTU)，計算Shannon-Wiener、Ace、Chao1、Simpson多樣性指數(shù)，對測序結果進行物種分類分析.

石油烴含量為3次測定結果的平均值. 經(jīng)3次平行測定，利用Excel 2010進行平均值和標準差計算，采用Originpro 9.0及Excel 2010軟件制圖.

2 結果與討論

2.1 生物修復可行性分析

陜北延長地區(qū)石油污染土壤質地為黃綿土，土壤中粉粒和砂粒占比共計77.1%，其通氣性能較好，可為生物修復提供較好的土壤質地條件.

研究[21-22]表明，當土壤C/N接近100∶10時，有助于土壤微生物對污染物進行降解代謝. 該研究中供試土壤總石油烴含量為 15 233 mg/kg，土壤總碳含量按總石油烴的85.1%計[23]，為 12 948 mg/kg，土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮總量為28.2 mg/kg，計算所得C/N為459∶1，遠高于保持微生物活性的最佳值. 因此，向污染土壤中補充氮素以提高微生物代謝活性的修復方式理論上可行. 污染土壤的自然含水量為5.1%，文獻報道的適合微生物降解污染物的土壤含水量為15.1%～30%[24]，因此需要向土壤中補充水分以促進石油烴的降解.

Abalos等[25]研究發(fā)現(xiàn)，當石油烴降解菌總數(shù)為108CFU/g時，對石油烴的代謝活性最強. 該研究土壤中石油烴降解菌總數(shù)為3.30×105CFU/g，低于文獻[25]報道結果. 因此，理論上需要向土壤中接種降解菌進行生物強化修復處理.

通過分析土壤含水量、土壤C/N、土壤中降解菌數(shù)量，確定對接種降解菌進行生物強化修復和施入氮素進行生物刺激修復的兩種修復方式.

2.2 生物強化修復

2.2.1石油烴降解菌群的篩選

從石油污染土壤中通過富集培養(yǎng)獲得了石油烴降解菌群MC(見圖1). 利用高通量測序分析石油烴降解菌群的主要組成：變形菌門(Proteobacteria，99.75%)—γ-變形菌綱(Gamma-proteobacteria，99.49%)—假單胞菌目(Pseudomonadales，99.36%)—莫拉氏菌科(Moraxellaceae，87.33%)—不動桿菌屬(Acinetobacter，87.00%)和假單胞菌科(Pseudomonadaceae，12.04%)—假單胞菌屬(Pseudomonas，12.00%).

注： 圖形紅色部分從內到外依次為門、綱、目、科、屬，顏色越深，表示占比(豐度)越大. 圖1 石油烴降解菌群(MC)種群結構Fig.1 Population structures of petroleum hydrocarbon degrading flora (MC)

不動桿菌屬和假單胞菌屬是文獻報道中常見的石油烴降解菌. ?mer等[26]、Zhang等[27]、武海杰等[28]分別從土耳其、中國上海市和新疆克拉瑪依地區(qū)污染土壤中篩選出可降解石油的不動桿菌屬；Pacwa-Pociniczak等[29]、任隨周等[30]、曹冠楠等[31]分別從波蘭、中國廣東省和北京地區(qū)污染土壤中篩選出了可降解石油烴的假單胞菌屬；楊茜等[32]利用Bush-hass培養(yǎng)基從陜北地區(qū)石油污染土壤中篩選出的石油烴降解菌主要為假單胞菌屬和不動桿菌屬. 這些結果都說明假單胞菌屬和不動桿菌屬是在不同地理區(qū)域環(huán)境中普遍存在的石油烴降解菌菌屬.

2.2.2接種降解菌群MC對石油烴的去除效果

在兩種不同土壤含水量(5.1%的自然含水量和15.1%含水量)條件下，向石油污染土壤中接種108CFU/g的降解菌群MC修復60 d，對石油烴的去除效果如圖2所示. 結果表明，在自然含水量(5.1%)條件下修復60 d，土壤中石油烴含量由 15 233 mg/kg降至 13 617 mg/kg，去除率為10.61%(見圖2中NBA曲線)，未接種降解菌群的對照組(NCK)總石油烴含量由 15 233 mg/kg降至 14 422 mg/kg，去除率為5.32%. 可見，5.1%的自然含水量條件下接入的降解菌群對土壤中石油烴起到了一定的去除作用.

在15.1%含水量條件下接種降解菌群MC修復60 d，土壤中石油烴含量由 15 233 mg/kg降至 12 511 mg/kg，去除率為17.87%(見圖2中ABA曲線)，15.1%含水量條件下未接種的對照組(ACK)中總石油烴含量由 15 233 mg/kg降至 13 833 mg/kg，去除率為9.19%(見圖2中ACK曲線). 相比對照組NCK與ACK，接種降解菌群MC對土壤中石油烴起到了較好的去除作用. 與5.1%的自然含水量相比，增加土壤含水量可提高菌群MC對石油烴的降解率. 總體上兩種含水量條件下降解菌群對土壤中石油烴的去除效果相對較差.

圖2 不同處理下土壤中石油烴的生物去除效果Fig.2 The effects of bioremediation strategy on petroleum hydrocarbon removal in the soils with different treatments

左麗敏等[33]比較了向污染土壤中接種石油烴降解菌群(優(yōu)勢菌為假單胞桿菌屬，分別為無菌水菌懸液和LB菌懸液)對石油烴的去除效果，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過58 d的修復，接種LB菌懸液的土壤石油烴去除率為30.2%，與接種無菌水菌懸液的土壤石油烴降解率相差不大. 這說明加入碳源、氮、磷、鉀可提高石油烴污染土壤微生物的活性，促進石油烴的降解. Bento等[34]利用篩選出的石油烴降解菌群(構成為蠟狀芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、梭形芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、不動桿菌和假單胞菌)對美國長島和中國香港兩個地區(qū)的石油污染土壤進行生物強化修復，經(jīng)過12周的處理，美國長島石油污染土壤中C12～C23直鏈烷烴的去除率為75.2%(自然衰減率為48.7%)，C23～C40直鏈烷烴的去除率為72.7%(自然衰減率為45.7%)；而中國香港污染土壤中C12～C23直鏈烷烴的去除率為17.8%(自然衰減率為23.3%)，C23～C40直鏈烷烴的去除率為7.3%(自然衰減率為7.5%)，說明同一降解菌群對不同地區(qū)土壤中石油烴的去除效果差異顯著. 生物強化修復的效果既受土壤質地條件的影響，也受菌群存在形式的影響. 該文篩選出的菌群MC對液相中濃度為 10 000 mg/L的石油烴降解率可達到89.28%，但是對黃綿土中石油烴的降解效率較低，僅為17.87%[35].

2.2.3生物強化降解菌群在土壤中的生長和存活

利用高通量測序研究了降解菌群MC在土壤中的生長和存活情況(見圖3)，結果表明，石油污染原土壤中變形菌門的相對豐度為28.22%，γ-變形菌綱(Gammapro-teobacteria)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、不動桿菌屬(Acinetobacter)的相對豐度分別為6.36%、0.33%、0.04%、0.04%；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)的相對豐度分別為0.29%和0.26%.

圖3 接種降解菌生物強化對土著微生物菌群結構的影響Fig.3 The effects of bioaugmentation with the inoculated degrading bacteria MC on the structures of indigenous microbial flora

在5.1%和15.1%兩種含水量條件下向土壤中接種MC菌群修復7 d，土壤中變形菌門相對豐度分別增至66.35%和57.98%〔見圖3(a)〕，γ-變形菌綱(Gammapro-teobacteria)的相對豐度分別增至58.48%和40.69%〔見圖3(b)〕，假單胞菌目(Pseudomonadales)的相對豐度分別增至56.78%和35.38%〔見圖3(c)〕，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的相對豐度分別增至25.87%和30.30%；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的相對豐度分別增至30.91%和5.08%〔見圖3(d)〕，不動桿菌屬的相對豐度由0.04%分別增至25.86%和30.25%，假單胞菌屬的相對豐度由0.26%分別增至30.87%和5.03%〔見圖3(e)〕；修復60 d時，這些不同分類學上的菌種在土壤中仍保持較高的相對豐度〔見圖3〕.

降解菌群MC主要分類學組成見2.2.1節(jié)和圖1，在5.1%的自然含水量和15.1%含水量條件下向污染土壤中接種MC 7 d和60 d時，土壤中MC菌群優(yōu)勢門、綱、目、科、屬的相對豐度增加明顯，說明接種的降解菌群MC可在土壤中迅速生長并長期存活，且降解菌群的生長不受土壤含水量的影響.

2.2.4生物強化對土著菌群alpha多樣性的影響

微生物的alpha多樣性可通過豐富度和均勻度來表征. Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)主要用于表征土壤微生物的豐富度，二者數(shù)值越大，土壤微生物的豐富度越好；Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)主要用于表征土壤微生物群落的均勻度，Shannon-Wiener指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小時，土壤微生物均勻度越好[36-37].

接種降解菌群對土壤微生物多樣性的影響見表3. 結果表明，5.1%的自然含水量條件下，接種降解菌群修復7 d，土壤微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)由7.29降至3.66， Ace指數(shù)由 11 841 降至 9 653，隨修復時間的增加，Shannon-Wiener指數(shù)和Ace指數(shù)持續(xù)下降. 15.1%含水量條件下接種降解菌群的土壤微生物群落多樣性指數(shù)也呈降低趨勢，但降低程度低于自然含水量條件下的接種處理，說明在15.1%含水量條件下向污染土壤中接種降解菌，能較好地保持土壤微生物多樣性，這與已有研究結果[38]一致.

表3 生物修復對土壤微生物多樣性的影響

生物強化修復顯著降低了土壤菌群的多樣性，土壤中石油烴降解率最高僅為17.87%(見2.2.2節(jié))，說明石油烴的降解作用不是依靠某些特異性降解菌的降解作用，而是依靠多種微生物的協(xié)同代謝作用，土壤微生物物種越豐富，分布越均勻，越有利于土壤污染物的去除.

2.3 生物刺激修復

2.3.1最佳氮源的確定

向污染土壤中分別施入尿素、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、NaNO35種不同類型的氮素，設置土壤C/N為100∶10下修復30 d，在5.1%的含水量條件下，5種氮素對總石油烴的去除率分別為10.41%、10.07%、9.38%、12.34%、9.17%；在15.1%的含水量條件下，5種氮素對石油烴的去除率分別為19.17%、19.72%、26.41%、24.69%、18.27%. 5.1%自然含水量和15.1%含水量條件下未施入氮素的石油烴自然降解率分別為8.07%和10.69%. 相比未經(jīng)修復處理的污染土壤，施入氮素有利于石油烴的降解，且使用KNO3作為氮源對石油烴的去除效果較好〔見圖4(a)〕.

圖4 生物刺激修復最佳氮源和最佳C/N的確定Fig.4 The optimal nitrogen source and optimal C/N for biostimulation

2.3.2最佳C/N

使用KNO3作為氮源，比較C/N為100∶5、100∶10、100∶20時對土壤石油烴的去除效果. 當C/N為100∶20時，兩種含水量條件對石油烴的去除效果均較好，其中15.1%含水量條件下加入外氮源KNO3更有利于石油烴的去除〔見圖4(b)〕.

研究表明，適合石油烴降解的最佳C/N一般為100∶10[39]，該研究中測定得到的石油烴降解最佳C/N 為100∶20，該差異可能是由不同地區(qū)土壤中的微生物維持活性所需氮含量不同所致. 因此在對污染土壤進行修復時，需要結合土壤土質類型、微生物種群結構及氣候條件等因素，確定所需補充的最佳氮源類型及含量.

2.3.3生物刺激修復對石油烴的去除效果

根據(jù)2.3.1節(jié)和2.3.2節(jié)所得結果，在5.1%的自然含水量條件下，利用KNO3作為最佳氮源并調節(jié)土壤C/N為100∶20對污染土壤修復60 d，總石油烴含量由 15 233 mg/kg降至 12 480 mg/kg，去除率為18.07% (見圖2中NBS曲線). 在15.1%含水量條件下修復60 d，總石油烴含量由 15 233 mg/kg 降至 8 413 mg/kg，石油烴去除率為44.77%(見圖2中ABS曲線). 相比接種菌進行生物強化修復(見圖2中NBA和ABA曲線)，生物刺激修復對黃綿土中石油烴的去除效果更好.

2.3.4外源氮生物刺激的土壤菌群變化

經(jīng)生物刺激的石油污染土壤中優(yōu)勢菌相對豐度如圖5所示. 由圖5可見，向土壤中加入KNO3進行生物刺激修復，放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度由23.40%增至36.20%～40.01%. 一些主要的石油烴降解菌屬包括類諾卡氏菌屬(Nocardioides，7.3%)、諾卡氏菌屬(Nocardia，6.9%)、紅球菌屬(Rhodococcus，4.2%)的相對豐度增加明顯. 另外，生物刺激修復60 d時，在5.1%和15.1%的含水量下，土壤Shannon-Wiener指數(shù)為6.14和6.18，Ace指數(shù)分別為 10 018.98 和 10 156.00 (見表3). 總體上，相比生物強化修復，生物刺激對土壤細菌群落結構組成和多樣性的影響較小.

圖5 外源氮生物刺激修復對土壤菌群結構的影響Fig.5 The effects of exogenous nitrogen biostimulated remediation on the structures of soil microbial flora

葉茜瓊[40]研究了微生物修復對土壤菌群結構的影響，結果發(fā)現(xiàn)，生物強化修復處理使得土壤微生物的豐富度和均勻度均降低，微生物種類較單一. 生物刺激修復不會使土壤微生物群落結構發(fā)生明顯變化，較好地維持了土壤微生態(tài)的穩(wěn)定性. 該研究測定結果和文獻[40]報道結果一致.

3 結論

a) 利用接種降解菌群生物強化修復陜北地區(qū)石油污染黃綿土，在15.1%的含水量條件下修復60 d，石油烴的最高去除率為17.87%；相比生物強化修復，外源氮生物刺激有利于黃綿土中石油烴的去除，15.1%含水量條件下向土壤中加入KNO3使土壤C/N為 100∶20，修復60 d時土壤中石油烴的去除率最高可達44.77%.

b) 在不同含水量條件下接種的降解菌群均可在土壤中快速生長并長期存活. 接種降解菌的土壤微生物群落多樣性明顯降低，Shannon-Wiener指數(shù)由6.62～7.29降至3.09～5.77，Ace指數(shù)由 11 841.83～12 059.35 降至 7 842.22～11 234.11；向污染土壤中加入外源氮進行生物刺激修復，土壤細菌Shannon-Wiener指數(shù)和Ace指數(shù)略有降低，由7.29～6.62和 11 841.83～12 059.35 分別降至6.14～6.18和 10 018.98～10 156.00. 相比生物強化修復，生物刺激修復可以維持土壤多樣性不發(fā)生明顯變化. 石油烴的降解作用不是依靠某些特異性降解菌的降解作用，而是依靠多種微生物的協(xié)同代謝作用，土壤微生物物種越豐富，分布越均勻，越有利于土壤污染物的去除.