邱 剛，房保栓，李永杰，范詒忠，潘慶亞，張獻(xiàn)波，郭 韜

(1. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2. 清河縣中心醫(yī)院，河北 清河 054800)

嗎啡是在19世紀(jì)初被科學(xué)家從阿片中提取的一種生物堿，是一種重要的阿片類藥物[1]。目前臨床上嗎啡被廣泛用于鎮(zhèn)靜、止痛，可以使患者產(chǎn)生強(qiáng)烈的欣快感，但是長期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)精神異常、認(rèn)知障礙、行為不受自主控制等異常，并且隨著劑量的增加，最終導(dǎo)致成癮。這種成癮主要表現(xiàn)為精神和軀體依賴，精神依賴表現(xiàn)為對(duì)藥物的渴求和覓藥行為，軀體依賴表現(xiàn)為對(duì)藥物的耐受和行為敏化。精神依賴是嗎啡誘導(dǎo)的行為敏化的主要表現(xiàn)，嗎啡成癮最特征性的表現(xiàn)是行為敏化。行為敏化是指生物反復(fù)接受某種依賴性藥物(如尼古丁、嗎啡、酒精等)后，出現(xiàn)的自發(fā)性活動(dòng)反應(yīng)增強(qiáng)的現(xiàn)象[2]，在動(dòng)物身上主要表現(xiàn)為自發(fā)性運(yùn)動(dòng)活性增加。有多種神經(jīng)回路系統(tǒng)參與嗎啡成癮和行為敏化的過程，其中中腦-邊緣多巴胺系統(tǒng)是所有成癮類藥物產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在把情緒轉(zhuǎn)化為意向行為的過程中起重要作用[3]。本研究通過建立嗎啡貓行為敏化模型，探討了行為敏化與腦組織神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性，旨在為臨床合理治療藥物成癮提供行為學(xué)及病理學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性家貓12只，體重2～3 kg，由河北省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(冀)2020-005，飼養(yǎng)條件為室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度55%～70%,動(dòng)物在籠中飼養(yǎng)，自由攝食飲水，喂家貓顆粒料。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品 鹽酸嗎啡注射液，沈陽第一制藥廠，國藥準(zhǔn)字H21022436，麻醉藥品和精神藥品生產(chǎn)定點(diǎn)批件號(hào)：TD2006-0028。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將12只貓隨機(jī)分為對(duì)照組3只和實(shí)驗(yàn)組9只，參照文獻(xiàn)[4]方法造模。①行為敏化誘導(dǎo)階段(第1～5天)：實(shí)驗(yàn)組貓于每日8點(diǎn)、12點(diǎn)、16點(diǎn)皮下注射鹽酸嗎啡注射液，第1天2.5 mg/kg，第2天5 mg/kg，第3天7.5 mg/kg，第4天10 mg/kg，第5天12.5 mg/kg，連續(xù)5 d；對(duì)照組貓?jiān)谕瑯拥臅r(shí)間和部位注射等量的生理鹽水。②行為敏化戒斷階段(第6～8天)；2組貓無任何處理3 d。③行為敏化檢測(cè)階段(第9天)：2組干預(yù)方法同行為敏化誘導(dǎo)階段。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1貓行為敏化檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第9天，依照文獻(xiàn)[2]中相關(guān)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定2組貓敏化行為，包括扭體、濕狗樣抖、站立、跳躍、清理皮毛、齒顫、上瞼下垂，其中上瞼下垂每2 min評(píng)定1次，觀察60 min，記錄上述行為發(fā)生次數(shù)。

1.4.2腦組織病理學(xué)觀察 在造模后的第3周對(duì)2組貓進(jìn)行腦組織取材，制備電鏡標(biāo)本：用3%戊巴比妥以1 mL/kg的劑量對(duì)貓進(jìn)行腹腔注射麻醉，剪開貓的胸前壁，暴露出心臟，用250 mL生理鹽水灌入升主動(dòng)脈，接著用含4%多聚甲醛的PBS液繼續(xù)灌注，依次留取貓的額、顳、頂、枕葉組織。將腦組織切割為1 mm3左右小塊，用2.5%戊二醛固定，制成超薄切片，JEM-1230(JEOL Electron Microscope，Japan)透射電鏡下觀察照相。

2 結(jié) 果

2.12組貓行為敏化情況比較 2組貓均無死亡。實(shí)驗(yàn)組貓的扭體、濕狗樣抖、站立、跳躍、清理皮毛、齒顫、上瞼下垂次數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)組貓出現(xiàn)行為敏化現(xiàn)象，對(duì)照組貓無行為敏化。見表1。

表1 對(duì)照組和嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)第9天貓行為敏化次數(shù)比較次)

2.22組貓腦組織電鏡下病理表現(xiàn)

2.2.1實(shí)驗(yàn)組 貓皮質(zhì)神經(jīng)元大多呈凋亡狀態(tài)，并且早、中、晚期均有凋亡的神經(jīng)元。凋亡早期：細(xì)胞失水，神經(jīng)細(xì)胞固縮，胞漿減少，細(xì)胞器濃縮，細(xì)胞核異染色質(zhì)輕度濃縮、邊集，電子密度高于正常；核仁消失，核膜尚完整；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體腫脹、空泡樣變性，見圖1。凋亡中期：細(xì)胞核異染色質(zhì)進(jìn)一步濃縮，均質(zhì)無結(jié)構(gòu)，電子密度進(jìn)一步升高，并且出現(xiàn)尼氏體、線粒體溶解。凋亡晚期：核異染色質(zhì)高度聚集、邊集，核裂解形成碎片，碎片形態(tài)不一，電子密度有所下降，核膜不規(guī)則或出現(xiàn)核膜破裂，胞漿內(nèi)可觀察到被吞噬的凋亡小體。神經(jīng)元軸突、樹突及突觸發(fā)生多種超微結(jié)構(gòu)改變：胞突及線粒體腫脹，空泡化，胞突透亮，見圖2；胞突微絲結(jié)構(gòu)崩解，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體擴(kuò)張，核電子密度增加，核周隙擴(kuò)張，見圖3；胞突電子密度明顯升高；軸質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，髓鞘脫層、斷裂，見圖4；部分腦皮質(zhì)突觸密集，可見大量的軸-軸突觸、軸-樹突觸，突觸小泡密集，見圖5。中樞神經(jīng)元變性壞死，具體表現(xiàn)為線粒體瘠消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，細(xì)胞核周間隙變大，核膜模糊不清，染色質(zhì)邊集，見圖6。額、顳、頂、枕葉部位的神經(jīng)元病變類型及程度無明顯差異。

圖1 電鏡下嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組貓腦組織神經(jīng)元凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(×5k)

圖2 電鏡下嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組貓腦組織神經(jīng)元胞突及線粒體腫脹、空泡化(×10k)

圖3 電鏡下嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組貓腦組織神經(jīng)元線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體擴(kuò)張(×5k)

圖4 電鏡下嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組貓腦組織神經(jīng)元軸質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，髓鞘脫層、斷裂(×5k)

圖5 電鏡下嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組貓腦組織神經(jīng)元突觸、突觸小泡密集(×30k)

圖6 電鏡下嗎啡暴露實(shí)驗(yàn)組貓腦組織神經(jīng)元固縮，線粒體瘠消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，細(xì)胞核周間隙變大，核膜模糊不清(×5k)

2.2.2對(duì)照組 貓的腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核電子密度低，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞核核膜清晰可見，染色質(zhì)密度正常，見圖7。

圖7 電鏡下對(duì)照組貓腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，排列整齊(×6k)

3 討 論

嗎啡有許多藥理作用，包括鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催吐、抑制呼吸等，但嗎啡被吸收入血后可以通過血腦屏障直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，使神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙或壞死，造成永久性功能損傷[5]。Robinson等[6-7]認(rèn)為嗎啡可以持久地改變腦神經(jīng)環(huán)路，使神經(jīng)環(huán)路對(duì)嗎啡類藥物的刺激持續(xù)超敏，從而使軀體產(chǎn)生對(duì)嗎啡的依賴。嗎啡成癮患者出現(xiàn)行為敏化后，其所表現(xiàn)的神經(jīng)及精神癥狀復(fù)雜多樣。從行為學(xué)角度來看, 嗎啡成癮以及行為敏化的產(chǎn)生是一種特殊的惡性學(xué)習(xí)、記憶過程, 是一種畸形記憶[8]。突觸可塑性的變化是正常記憶形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，一旦突觸的可塑性發(fā)生改變，就會(huì)形成畸形記憶，最終發(fā)展為對(duì)嗎啡持續(xù)和頑固的依賴作用。 在本實(shí)驗(yàn)中，貓應(yīng)用嗎啡后出現(xiàn)行為敏化，是阿片類藥物成癮的特征性表現(xiàn)，與吸毒者應(yīng)用毒品后的表現(xiàn)很相似，說明在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)可以在一定程度上解釋嗎啡對(duì)人體的毒性損害。

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制，使細(xì)胞程序性死亡的現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡維持著生物體自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)個(gè)體的生長發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)具有重要的作用。Bajic等[8]發(fā)現(xiàn)，給予大鼠注射嗎啡后，其大腦皮質(zhì)與杏仁核出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡。Hassanzadeh等[9]和Shafie等[10]發(fā)現(xiàn)，在嗎啡的作用下，抗凋亡因子Bcl-2水平下降，大腦神經(jīng)元發(fā)生凋亡。封小強(qiáng)等[11]研究表明，嗎啡能夠損傷神經(jīng)元中線粒體的超微結(jié)構(gòu)，影響線粒體的正常功能，最終使整個(gè)細(xì)胞的能量代謝發(fā)生障礙，從而抑制腦的功能活性，是嗎啡導(dǎo)致神經(jīng)中樞出現(xiàn)功能障礙的始動(dòng)因素。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用電鏡觀察貓的腦組織，發(fā)現(xiàn)嗎啡暴露貓的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、變性、死亡，細(xì)胞核核膜模糊不清，染色質(zhì)邊集等，中樞神經(jīng)元大部分呈凋亡狀態(tài)，主要以尼氏體溶解、水樣變性為主；神經(jīng)元細(xì)胞器各組分的多種超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張、線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等；神經(jīng)元的軸突、樹突也發(fā)生了病理性改變，在部分腦組織中突觸小泡密集存在，可見較多的軸-軸突觸、軸-樹突觸，這說明嗎啡可能對(duì)大腦皮質(zhì)的軸突、樹突和突觸數(shù)量產(chǎn)生影響。嗎啡使中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡、變性、壞死后，機(jī)體為了維持正常的生理功能，周圍存留的細(xì)胞會(huì)發(fā)出側(cè)支，形成新的突觸，以維持軀體正常的神經(jīng)功能[4]。神經(jīng)元的突觸不斷丟失和重組，使神經(jīng)細(xì)胞間的正常秩序受到破壞，這可能是嗎啡誘導(dǎo)貓產(chǎn)生行為敏化的神經(jīng)電生理學(xué)基礎(chǔ)。另外嗎啡可以作用于多處大腦功能區(qū)，包括紋狀體和多巴胺能神經(jīng)支配的靶點(diǎn)，如前額葉皮質(zhì)、杏仁核、海馬等，這些區(qū)域都屬于嗎啡成癮腦內(nèi)“獎(jiǎng)賞環(huán)路”上的重要環(huán)節(jié)[12-13]。王建材等[14]發(fā)現(xiàn)嗎啡可以使海馬的樹突棘消失，從而引起海馬的損傷。Erbs等[15]發(fā)現(xiàn)嗎啡可以減少海馬區(qū)阿片受體細(xì)胞的密度并使其重新分布，使海馬功能發(fā)生改變。這些區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞凋亡必將嚴(yán)重影響離子通道開放、突觸傳遞、受體結(jié)合等分子生物學(xué)過程，造成相關(guān)神經(jīng)活動(dòng)、行為運(yùn)動(dòng)、自身調(diào)節(jié)紊亂，最終導(dǎo)致行為敏化現(xiàn)象。說明神經(jīng)元凋亡既是嗎啡神經(jīng)毒性直接作用的結(jié)果，也是行為敏化產(chǎn)生的病理解剖學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，嗎啡可導(dǎo)致多種腦組織病理損害，嗎啡成癮貓的行為敏化與腦神經(jīng)元凋亡有密切關(guān)系。但嗎啡成癮不是單一的誘導(dǎo)機(jī)制，嗎啡誘導(dǎo)行為敏化的機(jī)制是十分復(fù)雜的，涉及一系列微觀調(diào)控系統(tǒng)的改變，深入研究戒斷行為與細(xì)胞凋亡在嗎啡成癮、神經(jīng)毒害等方面的關(guān)系，有望為戒斷嗎啡和脫癮后復(fù)吸的治療、預(yù)防提供新的研究思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。