代玉梅 朱品謀 林茗嫣 劉云鋒（廣州醫(yī)科大學附屬婦女兒童醫(yī)療中心臨床檢驗部，廣州510623）

抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎［（antineutrophil cytoplasmic autoanti-body，ANCA）-associated vasculitis，AAV］是一類以原發(fā)或繼發(fā)性小、中血管結構反應性損傷伴血管壁白細胞浸潤為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病［1］。ANCA在其發(fā)病、診斷及臨床分類中具有重要價值［2］。雖然AAV在兒童中發(fā)病率較低，若累及腎臟等器官可能會造成嚴重后果［3］。目前臨床試驗室用于AAV篩查的常規(guī)項目是血管炎4項：間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）判斷ANCA類型為核周型（perinuclear pattern，pANCA）、胞漿型（cytoplasmic pattern，cANCA）或非典型（atypical pattern，aANCA）；ELISA鑒定靶抗原髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和/或蛋白酶3（proteinase 3，PR3）。用于ANCA IIF分析的基質片有單基質、雙基質、多基質等。本研究采用歐蒙公司生產的、經甲醛和乙醇固定的正常中性粒細胞構成的雙基質片。

課題組發(fā)現，某些患兒的血清標本在排除黃疸等干擾因素影響且標準化操作下，仍會在基質片上呈現較強的綠色熒光背景，產生原因不明。本研究以2016年1月至3月初診并行血管炎4項篩查的AAV患兒為對象，比較分析ANCA陽性高背景組、ANCA陽性無背景組與血管炎4項檢測均陰性組患兒血清主要的免疫學指標（IgG、IgE，補體C3、C4）、肝臟生化指標［白蛋白（ALB）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）］和血液學指標［白細胞計數（WBC）、淋巴細胞計數（LYMP）、中性粒細胞計數（NEUT）、血小板計數（PLT）、血小板寬度（PDW）等］，觀察高背景cANCA陽性AAV患兒的實驗室特征，并探討非特異性綠色熒光背景產生的可能原因。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2016年1月至3月初我院收治的初診、行血管炎4項檢測的AAV患兒，分組收集ANCA陽性高背景、ANCA陽性無背景、血管炎4項均呈陰性的血清標本共90例（30例/組，剔除溶血、脂血、黃疸標本），同時收集患兒外周EDTA抗凝血標本進行相關血液學指標分析。

1.1.2 主要試劑與儀器ANCA IIF檢測試劑盒、anti-MPOELISA檢測試劑盒、anti-PR3 ELISA檢測試劑盒（德國歐蒙）；IgG、IgE、C3、C4診斷試劑盒（美國貝克曼庫爾特）；ALB、ALT、AST生化分析試劑盒（北京九強）；BX517R-32FB3-F01免疫熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；IMMAGE 800特種蛋白分析儀（美國貝克曼庫爾特）；全自動生化分析儀（7600，日本日立）；System XE-5000全自動血液分析儀（美國希森美康）。

1.2 方法

1.2.1 血管炎4項檢測 待檢血清（起始稀釋度為1∶10）采用ANCA IIF雙基質檢測試劑盒進行IIF染色，熒光顯微鏡下由2名資深技術專家判斷ANCA的熒光模式：乙醇基質中顯示分布在整個中性粒細胞胞漿中的顆粒型熒光為胞漿型（cANCA），中性粒細胞核周顯示光滑帶狀熒光為核周型（pANCA），注意排除抗核抗體（ANA）干擾。熒光高背景：常規(guī)IIF染色，固定中性粒細胞的背景基質呈可見的較強綠色熒光；熒光無背景：常規(guī)IIF染色，固定中性粒細胞的背景基質無明顯可見綠色熒光。采用anti-MPO/PR3 ELISA試劑盒半定量分析待檢血清中的靶抗原。

1.2.2 免疫球蛋白及補體檢測 血清IgG、IgE、C3、C4按照商品化試劑盒操作說明書采用IMMAGE 800全自動酶免儀分析。

1.2.3 肝臟生化指標及血液學指標檢測 采用ALB、ALT、AST試劑盒及7600全自動生化分析儀定量分析待測血清中相應生化指標，血液分析儀System XE5000常規(guī)分析患兒外周血WBC、LYMP、NEUT、PLT和PDW，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用Chi-square進行二分類資料檢驗；計量資料多組間比較采用Ordinary Oneway ANOVA檢驗；組間兩兩比較采用Turkey's multiple comparison test。P＜0.05為 差 異 具 有 統(tǒng) 計 學意義。

2 結果

2.1 受試人群一般臨床特征ANCA陽性高背景組患兒74%為男性（20/27），平均年齡略高于ANCA陽性無背景組。ANCA陽性高背景組與ANCA陽性無背景組患兒血清cANCA、pANCA、MPO陽性率存在顯著差異（P＜0.01，表1）。IIF染色后，雙基質片中，27例ANCA陽性高背景組患兒血清在乙醇側（EOH）主要表現為具有較強綠色熒光背景的弱陽性cANCA核型（44.44%，僅1例pANCA），甲醛側（HCHO）熒光染色均為陰性（或弱陽性）；25.93%（7/27）患兒靶抗原為MPO，14.82%（4/27）患兒靶抗原為PR3。ANCA陽性無背景組患兒血清在雙基質片中則僅在已固定的中性粒細胞核周或胞漿出現典型綠色熒光，核型主要為陽性或弱陽性pANCA（64.29%，18/28），背景干凈清晰、無綠色熒光；39.29%（11/28）患兒靶抗原為MPO，10.71%（3/28）患兒靶抗原為PR3。ANCA陽性高背景及無背景患兒血清多伴有低滴度ANA（圖1）。

表1 ANCA陽性高背景組、陽性無背景組及陰性人群血管炎4項分析［±s，例（%）］Tab.1 Analysis of 4-items vasculitis in positive high background group，positive no background group and negative population［±s，n（%）］

表1 ANCA陽性高背景組、陽性無背景組及陰性人群血管炎4項分析［±s，例（%）］Tab.1 Analysis of 4-items vasculitis in positive high background group，positive no background group and negative population［±s，n（%）］

Features Male/Female Age（month）cANCA（+）pANCA（+）MPO（+）PR3（+）ANCA+With background（n=27）20/7 65.3±10.02 12（44.44）1（3.70）7（25.93）4（14.82）Without background（n=28）12/16 34.71±8.19 6（21.43）18（64.29）11（39.29）3（10.71）ANCA-（n=30）12/18 67.71±9.68 0 0 0 0 P＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

圖1 IIF高背景ANCA在乙醇/甲醛基質中的代表性結果Fig.1 Representative results of IIF high background ANCA in EOH/HCHO fixed matrix

2.2 ANCA陽性高背景組患兒免疫學指標3組受試患兒血清IgG、IgE、C3、C4分析結果如圖2所示，ANCA陽性高背景組血清IgG水平［（9.87±4.34）μg/ml］顯著低于ANCA陽性無背景組［（13.89±6.43）μg/ml，P＜0.05］及陰性對照組［（10.39±4.75）μg/ml，P＞0.05］；ANCA陽性高背景組血清C3［（1.22±0.39）μg/ml］顯著高于ANCA陽性無背景組［（0.88±0.33）μg/ml，P＜0.05］和陰性對照組［（0.96±0.26）μg/ml，P＜0.01］；IgE、C4雖在ANCA陽性高背景組、ANCA陽性無背景組及陰性對照組呈逐漸增高或降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 ANCA陽性高背景組、ANCA陽性無背景組及陰性對照組免疫學指標比較Fig.2 Comparison of immunological index in ANCA positive high background group，ANCA positive no background group and negative control group

2.3 ANCA陽性高背景組患兒肝臟生化指標3組患兒肝臟生化指標檢測結果顯示，ANCA陽性高背景組ALB、ALT、AST水平均高于ANCA陽性無背景組及陰性對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 ANCA高背景組、ANCA無背景組及陰性對照組肝臟生化指標比較Fig.3 Comparison of liver biochemical indexes in ANCA high background group，ANCA no background group and negative control group

2.4 ANCA陽性高背景患兒血液學指標3組患兒血液學檢測指標分析結果顯示，ANCA陽性高背景組WBC、LYMP及PDW水平均高于ANCA陽性無背景組和陰性對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4）。ANCA陽性高背景組患兒PLT計數［（402.6±191.2）×1012個/L］顯著高于ANCA陽性無背景組［（302.3±22.9）×1012個/L，P＜0.05］；ANCA陽性高背景組RBC計數［（4.39±0.39）×1012個/L］與ANCA陽性無背景組患兒［（3.99±0.94）×1012個/L］低于陰性對照組［（4.49±0.40）×1012個/L］，且ANCA陽性無背景組與陰性對照組差異顯著（P＜0.05）。

圖4 ANCA陽性高背景組、ANCA陽性無背景組及陰性對照組血液學指標比較Fig.4 Comparison of hematological indexes in ANCA positive high background group，ANCA positive no background group and negative control group

3 討論

中性粒細胞活化及補體系統(tǒng)參與是AAV病程中的主要事件。臨床常根據ANCA在IIF染色時呈現的熒光模式和對應的靶抗原進行AAV診斷并判斷藥物療效。已知的ANCA靶抗原除MPO、PR3外，尚有殺菌/通透性增加蛋白酶、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白等［4］，目前臨床試驗室篩查較為普遍的是MPO和PR3。

課題組ANCA實際檢測發(fā)現，某些患兒的臨床血清標本在IIF染色時會出現較強的綠色熒光背景，而成人血清標本則鮮少出現此種情況。為探索這種非特異性熒光高背景產生的可能原因，課題組隨機留取行AAV篩查的ANCA陽性高背景、ANCA陽性無背景及血管炎4項均呈陰性的患兒血清標本，觀察ANCA陽性高背景血清標本的熒光類型及非特異性高背景的形成規(guī)律，并比較3組患兒的主要實驗室指標，尋找可能與綠色熒光背景相關的因素。

IIF分析結果顯示，高背景ANCA陽性病例性別構成多為男性，血清在雙基質片中呈現的皆為甲醛敏感型cANCA，靶抗原MPO、PR3陽性率分別為25.93%、14.82%，提示這些ANCA陽性高背景血清存在MPO、PR3以外的未知粒細胞（或單核細胞）自身抗原。ANCA陽性無背景組pANCA陽性率較ANCA陽性高背景組明顯升高，且多為pANCA和cANCA雙陽的混合模式，MPO檢出率相對較高（39.29%），提示pANCA相關兒童血管炎靶抗原與成人相似，多為MPO，這些初診的ANCA陽性無背景AAV患兒與高背景組患兒相比，年齡相對偏小，這種非典型的雙陽模式產生原因有待進一步研究。

循環(huán)型IgG在乙醇固定的中性粒細胞基質片上可呈現胞漿型熒光［5］。IgG的某些亞類水平與疾病鑒別診斷有關［6］。3組患兒血清免疫學指標檢測結果顯示，ANCA陽性高背景組總IgG水平低于ANCA陽性無背景組和陰性對照組，且與ANCA陽性無背景組存在顯著差異，提示疾病狀態(tài)下ANCA陽性無背景組患兒產生更高滴度的自身抗體。研究發(fā)現，治療AAV的藥物環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、利妥昔單抗等可能會誘導低IgG血癥和B細胞數減少［7-8］。這些小分子藥物半抗原可能會與患兒血清中的某些蛋白（或IgG）結合成完全抗原，刺激機體產生相應IgG，并與基質片上的抗原發(fā)生非特異性結合產生綠色高熒光背景。對初診患者而言，藥物對實驗結果的影響是不存在的，本研究發(fā)現，某些血管炎4項全陰性患兒抽血前及時靜注人IgG、阿司匹林或人源化單抗，IIF染色時也并未出現非特異性綠色熒光背景，提示藥物應用并非導致非特異性熒光背景的必然原因。若要排除藥物對于ANCA篩查時綠色背景的影響，需要更嚴格地挑選實驗對象、更精密的實驗設計以排除混雜因素（如血藥濃度、血藥半衰期、藥物代謝和藥物動力學等）的影響，以防得出有歧義的結論。

C3是體內最豐富的補體蛋白，3條補體激活途徑的啟動均需C3參與。C3是非常重要的炎癥介質，在調理吞噬、介導炎癥、趨化白細胞、調節(jié)免疫應答、溶解免疫復合物、針對自身小分子抗原的特異性抗體形成等免疫進程中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，補體活化在AAV病程中扮演重要角色［9］。MPO陽性的活動期AAV患者外周EDTA抗凝血漿補體降解物C3a、C5a、sC5b-9水平較正常人群較高，緩解期Bb、C3a、sC5b-9水平更高，而PR3陽性的活動期AAV患者C3a、C5a、sC5b-9和C4d水平較高，緩解期時C3a、C4d水平更高，血清C3較低的AAV患者生存率較低，腎功能預后相對較差［10］。本研究發(fā)現，ANCA陽性高背景組C3水平顯著高于ANCA陽性無背景組及陰性對照組，說明ANCA陽性高背景組患兒血清補體呈高活化狀態(tài)，非特異性綠色強熒光背景的產生可能與患兒血清C3水平有關。結合ANCA陽性高背景組及陽性無背景組患兒外周血RBC計數均低于陰性對照組，課題組認為C3及RBC的組間差異可能與患兒機體炎癥狀態(tài)及血液免疫復合物的清除有關；C3水平相對較高的ANCA陽性高背景組患兒預后可能相對較好。

AAV患者血液中的免疫細胞亞群尤其是調節(jié)淋巴細胞亞群的數目和功能與自身免疫應答的啟動、蔓延及自身抗體的產生有關［11］。PLT升高作為活動性AAV診斷的生物標志物，對區(qū)分活動期AAV和緩解期AAV、活動性疾病與急性感染有重要意義［12］。PLT/淋巴細胞比值（PLR）是臨床上評價患者疾病負荷的有效指數，與AAV診斷密切相關［13］。課題組發(fā)現，除RBC存在組間差異外，ANCA陽性高背景組患兒WBC、LYMP、PDW指標均高于ANCA陽性無背景組及陰性對照組，PLT計數也明顯高于ANCA陽性無背景組，除受患兒機體炎癥狀態(tài)和疾病活動度影響外，這種顯著差異可能也與研究對象的疾病構成有關。ANCA陽性高背景組有12例川崎病，陽性無背景組有5例過敏性紫癜。前者是一種以全身血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性小兒疾病，高發(fā)于5歲以下嬰幼兒（男多于女），患兒臨床特征多伴有WBC及PLT升高，過敏性紫癜患兒則多伴有PLT降低，異常增高的PLT是否是免疫熒光高背景形成的直接驅動因素有待深入研究。

綜上，伴有非特異性高熒光背景產生的ANCA多為甲醛敏感型cANCA，患者體內同時有較低滴度的ANA。本研究顯示，AAV患兒的炎癥狀態(tài)激活中性粒細胞、單核細胞、內皮細胞及補體系統(tǒng)，細胞損傷及損傷細胞胞內成分釋放作為新的抗原成分刺激宿主產生cANCA、ANA等抗體。非特異性綠色熒光背景的形成可能是PR3以外的新抗原在基質片上呈現的一種非典型的、新的熒光模式?；純貉簩W指標以低IgG、高C3、高PLT為特征，未來課題組將進一步驗證IgG（及亞類）、C3、PLT與ANCA間接熒光高背景的關系（排除C3、補給IgG等），并探索相關機制。