陽 莉 陳曉燕 蔡惠寧 陳偉材 盧建溪（中山大學附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣州510630）

外周血淋巴細胞是維持機體免疫功能的主要細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞等，這些細胞又可分成不同亞群［1-2］。采用流式細胞術(shù)進行淋巴細胞亞群分析，可以監(jiān)測和評價健康人群免疫功能，也能評估腫瘤患者、自身免疫性疾病和亞健康人群的免疫狀態(tài)，對疾病的診斷分期、預后評估、療效評價等均有重要指導意義［3-7］。

流式細胞術(shù)分析淋巴細胞亞群是臨床醫(yī)學常用的檢查項目，在檢測外周血時一般使用新鮮樣本進行檢測以保證檢測結(jié)果的準確性，但由于流式細胞儀儀器維護成本高，每次開機都要增加質(zhì)控微球、清洗液等試劑成本，在檢測量小的情況下，浪費人力、物力。因此，如何減少人力消耗、降低試劑和儀器維護成本，成為一個亟待解決的問題。有研究關(guān)注艾滋病、腫瘤、原發(fā)性失眠、結(jié)核等疾病患者淋巴細胞亞群的變化，但對標本保存時間和溫度對流式細胞儀檢測結(jié)果影響的研究較少。本文針對健康人群標本進行了樣本保存時間及溫度對流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群影響的研究，為流式樣本的保存時間提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本來源 采集的外周血均來自中山大學附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院，共23例，其中男性10例，女性13例；年齡21～74歲，中位年齡33歲，平均年齡（39.09±15.36）歲。

1.1.2主要儀器與試劑 采血管為BD真空采血管，內(nèi)含肝素鋰抗凝劑。PBS（美國Gibco公司）；人淋巴細胞分離液（挪威Axis-shield公司）；溶血劑、淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3、淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD8/CD4/CD3、CytoFLEXDaily質(zhì)控微球（美國Beckman Coulter公司）。Cyto-FLEX流式細胞分析儀（美國Beckman Coulter公司）；Centrifuge 5810R離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞分離 采集空腹抗凝全血5 ml，立即送至實驗室分離外周血單個核細胞。將抗凝全血以PBS稀釋混勻，緩緩加入帶有淋巴細胞分離液的離心管中，800 g離心20 min，提取白膜層細胞，PBS洗滌細胞，計數(shù)。按分組用于流式細胞儀檢測，或置于4℃繼續(xù)保存。

1.2.2 樣本的預處理23份樣本分離后的外周血單個核細胞分為立即檢測（D0組）、4℃保存1 d（D1組）、4℃保存2 d（D2組）、4℃保存3 d（D3組）和4℃保存5 d（D5組）共5組，每組取2×106個細胞。

1.2.3 流式細胞儀檢測 每次檢測前，用Cyto-FLEX流式細胞分析儀配套的CytoFLEXDaily質(zhì)控微球進行儀器性能狀態(tài)檢測和校正，合格后方能使用。每組樣本按淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3和淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD8/CD4/CD3實驗步驟進行染色后，上機分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件處理和分析數(shù)據(jù)。重復測量資料多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細胞物理參數(shù)變化情況D0、D1、D2、D3和D5組細胞的物理參數(shù)變化如下：5組細胞在FSC/SSC雙參數(shù)散點圖中的位置均未發(fā)生變化；在CD45-FITC/SSC-A雙參數(shù)散點圖中，D0、D1、D2和D3組淋巴細胞分群明顯，而D5組淋巴細胞分群不明顯且位置發(fā)生較大偏移（圖1）?？梢?，樣本處理4 d內(nèi)上機檢測淋巴細胞物理參數(shù)沒有明顯變化。

圖1 不同保存時間淋巴細胞物理參數(shù)變化Fig.1 Changes of physical parameters of lymphocyte in different storage times

2.2 淋巴細胞亞群變化情況D0、D1、D2、D3和D5組淋巴細胞亞群比例結(jié)果如圖2、表1所示。各組分別與D0組進行比較，總T細胞比例D5組比D0組明顯降低（P＜0.05），NKT細胞比例D3組和D5組均比D0組明顯降低（P＜0.05），B細胞比例D3組和D5組均比D0組明顯升高（P＜0.05），Th、Ts、CD4+/CD8+T、NK細胞比例各組與D0組比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 不同保存時間淋巴細胞亞群比例變化Fig.2 Changes of percentage of lymphocyte subsets in different storage times

表1 不同保存時間淋巴細胞亞群分類結(jié)果（±s，n=23，%）Tab.1 Data of lymphocyte subsets classifications for different storage times（±s，n=23，%）

表1 不同保存時間淋巴細胞亞群分類結(jié)果（±s，n=23，%）Tab.1 Data of lymphocyte subsets classifications for different storage times（±s，n=23，%）

Note：1）P＜0.05，compared with D0 group.

Lymphocyte subsets T（CD3+）Th（CD3+CD4+）Ts（CD3+CD8+）CD4+/CD8+B（CD3-CD19+）NK（CD3-CD56+）NKT（CD3+CD56+）D0 64.01±2.03 29.19±2.09 25.98±1.63 1.36±0.18 8.45±0.94 21.89±2.03 10.28±1.18 D1 65.36±2.60 32.60±2.21 26.26±1.80 1.21±0.17 7.91±0.96 19.29±1.76 9.63±1.20 D2 58.20±3.02 26.16±1.93 24.45±1.62 1.21±0.13 9.76±1.06 25.15±3.22 8.88±1.27 D3 62.57±3.46 25.71±1.93 25.79±1.80 1.24±0.18 11.33±1.051）22.01±3.08 7.08±1.151）D5 52.52±3.811）23.12±2.27 22.58±2.19 1.57±0.29 15.50±1.691）17.45±2.79 6.66±1.211）

3 討論

流式細胞術(shù)目前廣泛應用于臨床檢驗，用于建立淋巴細胞參考值范圍、評估機體免疫功能及疾病診斷治療等各個方面［8-10］。使用流式細胞術(shù)對淋巴細胞亞群各項表面分子進行檢測，已成為免疫調(diào)控研究及評價中常規(guī)而重要的指標。淋巴細胞根據(jù)表面標志的不同分為T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞等，而T淋巴細胞分為輔助和殺傷細胞亞群，在細菌和病毒感染、免疫缺陷病、腫瘤、原發(fā)性失眠或其他免疫性疾病等疾病的過程中淋巴細胞亞群都會發(fā)生變化［11-14］。流式細胞術(shù)被認為是淋巴細胞免疫表型分析的標準方法，可以比較細胞的大小和細胞內(nèi)顆粒的復雜程度，F(xiàn)SC/SSC值越大說明細胞體積越大和顆粒越多。不同抗凝劑、標本的保存時間和溫度、樣本制備方法等因素均可對流式細胞術(shù)分析結(jié)果產(chǎn)生影響［15］，從而需要實驗室建立涉及從標本采集到上機檢測整個過程的標準和穩(wěn)定的實施方案。

本研究在確定電壓和熒光補償?shù)葯z測條件后，在固定的檢測方案下，對立即檢測、4℃保存1 d、4℃保存2 d、4℃保存3 d和4℃保存5 d的樣本分別進行檢測，分析物理參數(shù)和細胞表面標志物的變化情況。CD45分子為白細胞共同抗原，可作為淋巴細胞的分類標志，本研究用FSC/SSC和CD45/SSC雙參數(shù)分析，CD45/SSC可避免樣本中殘存的其他血細胞對分析的影響，淋巴細胞、粒細胞和單核細胞分群更明顯。結(jié)果發(fā)現(xiàn)立即檢測、4℃保存1 d、2 d、3 d和5 d的細胞在FSC/SSC散點圖中的位置基本沒有變化；保持Lym設(shè)門位置不變，發(fā)現(xiàn)立即檢測、4℃保存1 d、2 d和3 d的細胞在CD45/SSC散點圖中的位置基本沒有變化，而4℃保存5 d的細胞位置向左和向下偏移且分群不明顯?？梢姡S著保存時間的延長，細胞物理和化學參數(shù)都發(fā)生變化。進一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著保存時間的延長，CD3、CD4、CD8、CD56等標記分子出現(xiàn)不同程度的熒光強度的減弱，可能是因為標本長期保存對表面抗原造成破壞。

綜上所述，對進行外周血淋巴細胞亞群分析的標本，在收到后立刻處理，用PBS于4℃條件保存3 d內(nèi)進行流式檢測結(jié)果比較穩(wěn)定。因此，對于標本量少的實驗室，可集中標本每3d開機檢測，在保證結(jié)果準確的前提下，節(jié)約人力和成本。