李亞光 鄧同興 趙克芳 馬廣耀 郭文濤（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，漯河462000）

原發(fā)性肝癌是世界上常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，每年約有84萬新診斷病例［1-2］。肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主要的原發(fā)性肝癌，約占原發(fā)性肝癌的75%～85%［3］。由于大多數(shù)患者無法早期診斷，很多HCC患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期。HCC的惡性程度高、進(jìn)展快、侵襲性強(qiáng)、確診病程晚、整體預(yù)后差等特征使其成為腫瘤防治工作的難點(diǎn)。早期準(zhǔn)確診斷肝癌可顯著提高臨床療效，減輕患者痛苦。然而，臨床技術(shù)如影像學(xué)和組織學(xué)方法只能檢測(cè)相對(duì)晚期的HCC患者［4］。因此，迫切需要新的、可靠的生物標(biāo)志物為臨床診治提供依據(jù)。

哺乳動(dòng)物三葉因子（trefoil factor，TFF）家族由3個(gè)7～12 kD蛋白酶抗性肽組成，該家族蛋白具有6個(gè)半胱氨酸殘基的獨(dú)特高度保守基序，即所謂的三葉結(jié)構(gòu)域［5］。目前三葉因子1（trefoil factor 1，TFF1）在腫瘤中的作用仍存在爭(zhēng)議。TFF1最初在乳腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，在不同的腫瘤組織（結(jié)腸癌、胰腺和卵巢）中，TFF1的異常表達(dá)與刺激細(xì)胞增殖、遷移、侵襲性和腫瘤擴(kuò)散相關(guān)［6-9］。最近研究報(bào)道顯示在胃癌中TFF1可以作為一種腫瘤抑制基因［10］。這些結(jié)果提示TFF1可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物。然而TFF1在肝癌中的表達(dá)情況及其過表達(dá)后對(duì)HCC細(xì)胞MHCC97H生物學(xué)行為的影響目前未見報(bào)道。本研究利用慢病毒載體使HCC細(xì)胞MHCC97H中TFF1過表達(dá)，進(jìn)一步探討細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，以期為肝癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人HCC細(xì)胞系MHCC97H購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；慢病毒載體LV5-GFP購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；PCR引物為廣州華大基因公司設(shè)計(jì)合成；TFF1、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)ProteinTech Group公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、HRP標(biāo)記的二抗、ECL發(fā)光試劑購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 TFF1與肝癌的臨床關(guān)聯(lián)分析 肝癌組織中TFF1表達(dá)的臨床數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//tcgadata.nci.nih.gov/tcga），利用該數(shù)據(jù)庫分析TFF1在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)。另取來源于漯河醫(yī)專第一附屬醫(yī)院32例肝癌組織和癌旁正常組織樣本，樣本收集于2017年1月至2019年8月，患者術(shù)前未經(jīng)放、化療和免疫治療。熒光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)不同組織中TFF1 mRNA的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染 將MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM中。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將TFF1的cDNA序列克隆到慢病毒載體LV5-GFP中。使用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，72 h后收集病毒上清，經(jīng)0.45 μm過濾器過濾用于感染MHCC97H細(xì)胞。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97H，制備成5×104個(gè)/ml的懸液。將細(xì)胞以2 ml/孔接種到6孔板中。24 h后用慢病毒（1×108TU/ml）感染，感染后用嘌呤霉素（2 μg/ml）處理細(xì)胞72 h以篩選陽性克隆，用熒光顯微鏡觀察陽性細(xì)胞。感染TFF1慢病毒的細(xì)胞為過表達(dá)組（overexpression TFF1 group，oe-TFF1組）；同時(shí)用不含TFF1的慢病毒感染細(xì)胞作為陰性對(duì)照組（negative control group，NC組）；用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白組（Blank組）。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)TFF1表達(dá) 使用TRIzol試劑提取肝癌組織和細(xì)胞中的總mRNA。紫外可見分光光度法確定濃度后，使用PrimeScript RT試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用獲得的cDNA作為模板，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列為：TFF1上游引物：5'-TGGGTTTTGGTTAGGGTGTT-3'；TFF1下游引物：5'-CTCATCCCTAACTCAAAATCA-3'；GAPDH上游引物：5'-CGAGATCCTCAACCAATCAA-3'，下 游 引 物：5'-GGTGGTCCAGGGTCGTTACT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃20 s，60℃30 s，72℃30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用相對(duì)定量（2-ΔΔCt法）計(jì)算靶基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot分析 收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，用PBS洗滌，在含有蛋白酶和堿性磷酸酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液中裂解30 min。提取各組總蛋白，用BCA法進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)通過10%SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，用稀釋的一抗（TFF1 1∶1 000、E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000、Vimentin 1∶1 000、GAPDH 1∶2 000）在4℃孵育過夜。TBST洗滌3遍后，將膜與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的二抗孵育1 h。TBST洗膜3遍，將膜與增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑一起孵育，X光片曝光成像。使用ImageJ軟件分析灰度值，并根據(jù)目標(biāo)蛋白條帶與GAPDH條帶的灰度值之比計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 遷移實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2遍，用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞制備成懸浮液，密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml。將150 μl細(xì)胞懸液添加到Transwell頂端腔室中，并將500 μl含20%血清的培養(yǎng)基添加到基底外側(cè)腔室中。48 h后，將腔室移出并用無菌PBS洗滌。用棉簽小心地擦拭微孔膜內(nèi)層中的細(xì)胞，95%乙醇固定6 min，然后用4 g/L結(jié)晶紫溶液染色。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.6 侵襲試驗(yàn) 將Matrigel膠用DMEM以1∶9的比例稀釋并加入上室中。凝膠凝固后，將含有10%FBS的500 μl DMEM加入到24孔板中，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，按照遷移實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 CCK-8試驗(yàn) 將細(xì)胞在96孔板（3×103個(gè)/孔）中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h。除去培養(yǎng)基，向各孔中加入100 μl含10%FBS的DMEM和10 μl CCK-8測(cè)定緩沖液。孵育4 h后，在450 nm處測(cè)定吸光度（OD）值。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 集落形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞500個(gè)/孔接種到6孔板中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，用PBS輕輕洗滌孔2次。75%乙醇固定后在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。PBS洗滌并使其自然干燥，然后拍攝集落并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，t檢驗(yàn)和單因素方差用于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFF1在肝癌患者中的表達(dá) 根據(jù)TCGA中的臨床信息，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，肝癌組織中TFF1的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A，P＜0.05）。通過qRT-PCR分析臨床樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，TFF1 mRNA的表達(dá)水平在肝癌組織中顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B，P＜0.05）。

圖1 TFF1在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of TFF1 in human hepatoma and normal tissues

2.2 慢病毒介導(dǎo)TFF1在MHCC97H細(xì)胞中高表達(dá)為了研究TFF1在肝癌中的作用，通過將慢病毒介導(dǎo)的TFF1轉(zhuǎn)染到MHCC97H細(xì)胞中。感染后3 d通過熒光顯微鏡觀察到超過90%的細(xì)胞表達(dá)GFP，這表明慢病毒載體成功感染了MHCC97H細(xì)胞（圖2A）。qRT-PCR結(jié)果表明與用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，TFF1轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中TFF1 mRNA的表達(dá)水平顯著增加（圖2B，P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照相比，TFF1轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中TFF1蛋白表達(dá)水平也顯著升高（圖2C、D，P＜0.01）。結(jié)果表明成功獲得了穩(wěn)定高表達(dá)TFF1的MHCC97H細(xì)胞。

圖2 慢病毒介導(dǎo)外源性TFF1在MHCC97H細(xì)胞中過表達(dá)Fig.2 Establishment of TFF1-overexpression MHCC97H cell line

2.3 TFF1過表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖和集落形成能力的影響 慢病毒介導(dǎo)TFF1過表達(dá)后，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，oe-TFF1組細(xì)胞的增殖明顯受到抑制（圖3A）。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，在慢病毒感染MHCC97H細(xì)胞14 d后，oe-TFF1組細(xì)胞集落形成降低（圖3B、C，P＜0.01）。這提示TFF1的過表達(dá)抑制了MHCC97H細(xì)胞的增殖和集落形成能力。

圖3 TFF1過表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of TFF1 overexpression on cell proliferation

2.4 TFF1過表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響 遷移實(shí)驗(yàn)表明，接種48 h后，與對(duì)照組相比，oe-TFF1組MHCC97H細(xì)胞遷移穿膜的數(shù)量為101.67±4.087，與對(duì)照組（135.83±3.87）相比顯著減少（圖4A、B，P＜0.01），表明TFF1過表達(dá)能抑制MHCC97H細(xì)胞的遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比，TFF1的過表達(dá)可以減少M(fèi)HCC97H細(xì)胞通過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量（圖4C、D，84.5±1.87 vs 109.5±4.28，P＜0.01）。說明過表達(dá)TFF1表達(dá)能抑制MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 TFF1過表達(dá)抑制MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲Fig.4 Overexpression of TFF1 attenuated migration and invasion of MHCC97H cells

2.5 TFF1過表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞EMT的影響Western blot檢測(cè)TFF1過表達(dá)后上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）和人波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比TFF1過表達(dá)組細(xì)胞中E-Cadherin表達(dá)增高，與之相反，Vimentin和N-Cadherin則在oe-TFF1組表達(dá)下降（圖5）。這提示細(xì)胞EMT進(jìn)程因TFF1過表達(dá)而被抑制，進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

圖5 TFF1過表達(dá)對(duì)EMT蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of TFF1 overexpression on expressions of EMT-related proteins

3 討論

TFF基因定位21號(hào)蛋白，該家族蛋白均含有一個(gè)或幾個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)特殊、穩(wěn)定性強(qiáng)，使得TFF家族蛋白有著耐熱、耐酸和耐蛋白酶水解的理化特質(zhì)。TFF1是三葉因子之一，作為一種分泌蛋白，在多種組織中均有表達(dá)，但主要高表達(dá)于胃腸道內(nèi)，發(fā)揮著胃腸道黏膜屏障和修復(fù)的生理功能［11］。TFF1能夠與黏蛋白結(jié)合發(fā)揮保護(hù)胃腸道的功能，同時(shí)還能夠促進(jìn)黏膜重建。TFF1在其他器官如回腸、結(jié)腸、唾液腺、胰腺、呼吸道、乳房和肝臟中均有表達(dá)，在其他部位的組織再生中發(fā)揮作用［12-13］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)TFF1在腫瘤形成過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)TFF1在胃癌中表達(dá)水平降低，TFF1敲除后小鼠更容易發(fā)生胃癌［14-15］。胃作為TFF1的主要表達(dá)器官，在發(fā)揮促進(jìn)組織再生的同時(shí)也作為一種腫瘤抑制因子存在。但是在結(jié)腸、乳腺、胰腺和前列腺腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)TFF1表達(dá)水平升高，能夠刺激細(xì)胞存活、遷移、侵襲性以及腫瘤擴(kuò)散，表明TFF1是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物［7-9］。在肝臟中發(fā)現(xiàn)受損肝細(xì)胞TFF1表達(dá)較弱。大多數(shù)肝癌是在肝炎和肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的，而肝炎和肝硬化都是需要再生的肝損傷，肝細(xì)胞中的TFF1在肝癌發(fā)生的早期可能具有促進(jìn)肝再生或者抑制肝癌發(fā)展的作用，TFF1在肝癌中的功能有待進(jìn)一步研究。

肝癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，TFF1在肝癌中的作用和功能報(bào)道較少。本研究根據(jù)TCGA中的臨床信息，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，肝癌組織中TFF1的表達(dá)降低。利用慢病毒介導(dǎo)使TFF1在MHCC97H細(xì)胞中過表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TFF1的過表達(dá)抑制了MHCC97H細(xì)胞的增殖和集落形成能力。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)TFF1能抑制MHCC97H細(xì)胞的遷移、侵襲能力。這些結(jié)果提示TFF1可能也是肝癌的一種潛在腫瘤標(biāo)志物，參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

EMT是細(xì)胞失去其上皮特性而獲得間充質(zhì)特征的過程，已被證明是癌癥進(jìn)展的重要步驟。在EMT期間，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性以及與基底膜鏈接等上皮表型，改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)并增加其運(yùn)動(dòng)性，所有這些均導(dǎo)致侵襲性表型［16-17］。EMT后的腫瘤細(xì)胞可以離開腫瘤塊并遷移到周圍的正常組織中，從而導(dǎo)致這些腫瘤的局部進(jìn)展［18］。此外，EMT會(huì)增加腫瘤細(xì)胞侵襲血管以及向新組織中上皮層的遷移，導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高，腫瘤患者的預(yù)后更差［19］。EMT的特征是上皮標(biāo)志物的表達(dá)降低同時(shí)間充質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)升高，其中E-鈣黏蛋白的下調(diào)和N-鈣黏蛋白和/或波形蛋白的上調(diào)為EMT的典型標(biāo)志［20］。本研究發(fā)現(xiàn)TFF1過表達(dá)后引起HCC細(xì)胞中E-Cadherin表達(dá)增高，與之相反，Vimentin和N-Cadherin則表達(dá)降低。結(jié)果提示EMT進(jìn)程因TFF1過表達(dá)而被抑制，進(jìn)一步導(dǎo)致HCC細(xì)胞侵襲與遷移能力的降低。TFF1在HCC的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，通過使TFF1在人HCC細(xì)胞MHCC97H中過表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及EMT的能力。這表明TFF1可能是HCC發(fā)生的一種抑制因子，可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物。鑒于TFF1作為一種分泌蛋白，利用TFF1治療肝癌有可能成為一種新的肝癌治療策略。