管 萍 劉文娟 盧鵬超 徐萌萌（湖北省天門巿第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天門431700）

癲癇（epilepsy，EP）是一種臨床常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有進(jìn)行性和反復(fù)性等特點(diǎn)，由大腦神經(jīng)細(xì)胞過度異常放電引起，持續(xù)發(fā)作可引發(fā)腦內(nèi)氧化應(yīng)激及炎癥，損傷腦組織，造成大腦認(rèn)知功能障礙，并增加患者患精神疾病的風(fēng)險，腦卒中、腦外部損傷、神經(jīng)系統(tǒng)過度放電等均可引發(fā)癲癇，膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是造成EP患者腦損傷，并進(jìn)一步促使其發(fā)作的主要原因［1-2］。PI3K/Akt/GSK-3β是體內(nèi)主要的存活信號通路，可調(diào)控氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，激活該通路，可抑制炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕腦缺血再灌注損傷，并通過促使核因子E2相關(guān)因子活化，降低γ射線引起的神經(jīng)毒性，由此推測，PI3K/Akt/GSK-3β信號可調(diào)控炎癥發(fā)生及進(jìn)展，可能是影響EP發(fā)作的潛在作用靶點(diǎn)［3-4］。葛根素是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物葛根的主要藥效成分之一，具有心腦血管保護(hù)、抗氧化、抗炎、降糖、保肝等藥理活性，可激活PI3K/Akt/GSK-3β信號，抑制鉛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，發(fā)揮腦保護(hù)作用，還可通過抗氧化應(yīng)激減輕乙醇導(dǎo)致的慢性腦損傷，并通過抑制過度自噬而改善缺血性中風(fēng)所致的腦損傷，因而推測葛根素可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路減輕癲癇發(fā)作［5-7］。本文通過建立EP模型小鼠，基于PI3K/Akt/GSK-3β通路對葛根素減輕癲癇小鼠癥狀的作用機(jī)制進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級BALB/c小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，許可證號：SCXK（滬）-2009-0001，購自蘇州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，所有小鼠均在本院動物房中飼養(yǎng)，動物房環(huán)境達(dá)到清潔級，并保持安靜、通風(fēng)良好，自由飲食、飲水，自然光照，溫度23℃，相對濕度45%，定時清洗、消毒鼠籠，隨時添加飼料、飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑及儀器 葛根素注射液（商品規(guī)格：2 ml∶0.1 g，國藥準(zhǔn)字：H20053731，湖北天圣康迪制藥有限公司）；LY294002（貨號HY-10108，美國MCE公司）；SOD檢測試劑盒（貨號S311，同仁化學(xué)研究所）；MDA檢測試劑盒［貨號JK-（a）-2197，上海晶抗生物工程有限公司］；小鼠IL-6及TNF-α ELISA試劑盒、小鼠ELISA試劑盒、兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β及p-GSK-3β一抗、羊抗兔 二 抗（貨 號ab100772、ab100785、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab75745、ab75745、ab150077，美國Abcam公司）；RIPA裂解液、BCA試劑盒、HE染色試劑盒（貨號P0013K、P0011、C0105，上海碧云天公司）等；Morris水迷宮（型號XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司）；酶標(biāo)儀（型號XElx800，美國Perkin Elmer公司）；切片機(jī)（型號CM3050S，德國Leica公司）；光學(xué)顯微鏡（型號SMZ745，日本尼康公司）；通用電泳儀（型號JY200C，上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；蛋白轉(zhuǎn)移電泳槽（型號Tanon-186，北京中慧天誠科技有限公司）；凝膠成像儀（型號GIS-500，Miulab公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組給藥 以35 mg/kg的劑量［8］腹腔注射戊四氮制備EP小鼠模型，隔天注射1次，共注射15次，然后觀察小鼠行為活動30 min判斷癲癇發(fā)作級別，參照Racine分級標(biāo)準(zhǔn)：面部出現(xiàn)陣攣為Ⅰ級；頸部肌肉出現(xiàn)痙攣并甩尾/節(jié)律性點(diǎn)頭為Ⅱ級；單側(cè)前肢出現(xiàn)抽搐為Ⅲ級；雙前肢出現(xiàn)抽搐為Ⅳ級；四肢出現(xiàn)抽搐，失去平衡，跳躍及跌倒等為Ⅴ級，如小鼠癲癇發(fā)作持續(xù)為Ⅳ級以上，表明模型制備成功，共建模53只，成功48只，隨機(jī)分為模型組、LY294002組、葛根素組、葛根素+LY294002組4組，每組12只，另取12只小鼠腹腔注射等劑量生理鹽水設(shè)為對照組。葛根素組、葛根素+LY294002組小鼠腹腔注射320 mg/kg［9］劑量的葛根素注射液，LY294002組、葛根素+LY294002組小鼠尾靜脈注射0.3 mg/kg［10］劑量的LY294002，對照組與模型組小鼠，以與LY294002組相同劑量的生理鹽水尾靜脈注射，同時腹腔注射與葛根素組等劑量的生理鹽水，每天1次，持續(xù)14 d。

1.2.2 小鼠癲癇發(fā)作檢測 給藥結(jié)束后24 h，觀察小鼠行為活動，記錄1 d之中小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間。

1.2.3 小鼠認(rèn)知功能檢測及標(biāo)本收集 以Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠認(rèn)知功能，參照文獻(xiàn)［11］及說明書中的步驟進(jìn)行操作，使用平均逃避潛伏期及穿越原平臺位置次數(shù)作為小鼠認(rèn)知功能的判斷標(biāo)準(zhǔn)。各組小鼠吸入乙醚麻醉后，眼眶取血1.5 ml，靜置15 min后，4℃離心20 min，收集上清液即獲得血清，儲存在-80℃冰箱中；斷頭處死后解剖，獲得大腦，剪碎后加入蛋白裂解液，勻漿制備為勻漿液，4℃離心20 min，收集上清液（蛋白樣品液），儲存在-80℃冰箱中。

1.2.4 小鼠腦組織SOD、MDA及血清IL-6、TNF-α水平檢測 將1.2.3中的血清、蛋白樣品液置于4℃冰箱中解凍，參照小鼠ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、TNF-α水平，取適量蛋白樣品液，參照SOD及MDA試劑盒說明書步驟檢測其中SOD、MDA水平，剩余進(jìn)行Western blot。

1.2.5 Western blot檢測小鼠腦組織PI3K/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白表達(dá) 將1.2.4中剩余的蛋白樣品液，采用BCA試劑盒（具體步驟參照說明書）測定其中蛋白總濃度，然后將各組蛋白濃度調(diào)至相同，取相同體積的各組蛋白樣品液上樣進(jìn)行電泳，分離蛋白后濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移全部蛋白至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中，于搖床上室溫封閉2 h，根據(jù)蛋白分子量截取目的蛋白條帶置于小盒中，各種蛋白做好標(biāo) 記，加 入 兔 源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β及p-GSK-3β一抗，于4℃冰箱中孵育過夜，TBST溶液漂洗后，以羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST溶液再次漂洗后，蛋白條帶以ECL顯色，然后以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，采用Quantity One軟件對圖像進(jìn)行分析，得到各組蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以±s表示計(jì)量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠癲癇發(fā)作情況 與對照組相比，模型組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)增加，持續(xù)時間明顯延長（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)減少，持續(xù)時間縮短（P＜0.05）；LY294002組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)增加，持續(xù)時間延長（P＜0.05）。與LY29-4002組相比，葛根素+LY294002組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)減少，持續(xù)時間縮短（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)增加，持續(xù)時間延長（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠癲癇發(fā)作情況（±s，n=12）Tab.1 Seizures of mice in each group（±s，n=12）

表1 各組小鼠癲癇發(fā)作情況（±s，n=12）Tab.1 Seizures of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group Number of attacks 0.00±0.00 15.24±3.421）2.47±0.322）22.45±2.641）2）3）16.47±3.571）3）4）Duration（s）0.00±0.00 45.03±9.071）2.06±0.282）64.89±10.581）2）3）46.67±9.161）3）4）

2.2 各組小鼠認(rèn)知功能 與對照組相比，模型組小鼠平均逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿越原平臺位置次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越原平臺位置次數(shù)增加（P＜0.05）；LY294002組小鼠平均逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越原平臺位置次數(shù)減少（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越原平臺位置次數(shù)增加（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠平均逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越原平臺位置次數(shù)減少（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠認(rèn)知功能（±s，n=12）Tab.2 Cognitive function of mice in each group（±s，n=12）

表2 各組小鼠認(rèn)知功能（±s，n=12）Tab.2 Cognitive function of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group Average escape latency（s）27.98±4.11 40.12±7.331）29.03±4.652）53.96±9.851）2）3）40.84±8.031）3）4）Times of crossing original platform 3.67±0.52 1.42±0.261）3.53±0.482）0.36±0.051）2）3）1.39±0.321）3）4）

2.3 各組小鼠腦組織MDA、SOD水平 與對照組相比，模型組小鼠腦組織MDA水平明顯升高（P＜0.05），SOD水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠腦組織MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05），LY294002組小鼠腦組織MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠腦組織MDA、SOD水平（±s，n=12）Tab.3 Levels of MDA and SOD in brain tissue of mice in each group（±s，n=12）

表3 各組小鼠腦組織MDA、SOD水平（±s，n=12）Tab.3 Levels of MDA and SOD in brain tissue of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group SOD（U/mg）223.04±35.17 71.87±16.451）218.36±41.432）28.87±3.951）2）3）70.03±15.931）3）4）MDA（nmol/mg）2.06±0.53 4.58±1.031）2.15±0.512）6.05±1.431）2）3）4.63±1.051）3）4）

2.4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與對照組相比，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠血清IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05），LY294002組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠血清IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠血清IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平（±s，n=12）Tab.4 Serum levels of IL-6 and TNF-α in each group（±s，n=12）

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平（±s，n=12）Tab.4 Serum levels of IL-6 and TNF-α in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group IL-6（pg/ml）35.02±2.23 79.96±9.471）35.87±2.342）101.38±16.121）2）3）80.65±13.861）3）4）TNF-α（pg/ml）38.01±2.47 84.23±5.241）38.69±2.412）112.06±18.571）2）3）84.94±5.781）3）4）

2.5 各組小鼠腦組織PI3K/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與對照組相比，模型組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β明 顯 降低（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β升高（P＜0.05）；LY294002組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織 中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β升高（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低（P＜0.05），見圖1、表5。

圖1 各組小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白免疫印跡檢測結(jié)果Fig.1 Western blot results of PI3K/Akt/GSK-3β pathway protein in brain tissue of mice in each group

表5 各組小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)（±s，n=12）Tab.5 Relative expression of PI3K/Akt/GSK-3β pathway related proteins in brain tissues of mice in each group（±s，n=12）

表5 各組小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)（±s，n=12）Tab.5 Relative expression of PI3K/Akt/GSK-3β pathway related proteins in brain tissues of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group p-PI3K/PI3K 0.91±0.14 0.32±0.061）0.84±0.132）0.09±0.011）2）3）0.30±0.051）3）4）p-Akt/Akt 0.96±0.16 0.36±0.071）0.90±0.142）0.11±0.021）2）3）0.35±0.081）3）4）p-GSK-3β/GSK-3β 1.01±0.18 0.37±0.081）0.94±0.122）0.12±0.031）2）3）0.36±0.091）3）4）

3 討論

戊四氮作為一種GABAA受體拮抗劑，可使中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，并過度放電，在短時間內(nèi)造成動物抽搐，出現(xiàn)癲癇癥狀，而腦神經(jīng)過度的放電及癲癇持續(xù)發(fā)作，可引發(fā)呼吸障礙、腦組織缺血缺氧，激活膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6等異常表達(dá)，促使腦部氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)發(fā)生并進(jìn)展，導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，損壞認(rèn)知功能［11-14］。本文通過腹腔注射戊四氮制備EP小鼠模型，結(jié)果顯示，建模小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)增加，發(fā)作持續(xù)時間及平均逃避潛伏期延長、腦組織MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平明顯升高，穿越原平臺位置次數(shù)減少，SOD水平明顯降低，表明戊四氮可引發(fā)氧化應(yīng)激及炎癥發(fā)生，造成小鼠腦組織過度氧化，損壞認(rèn)知功能，導(dǎo)致小鼠癲癇發(fā)作，揭示模型建立成功。

EP的臨床治療以苯二氮卓類藥物為主，可迅速減少癲癇發(fā)作，但EP患者大多需長期用藥，臨床常用的抗癲癇藥物存在易形成耐受性、長期療效差、毒副作用大等缺點(diǎn)，因此積極尋找更為安全有效的治療藥物至關(guān)重要［15］。葛根素提取自中藥葛根，可抗氧化、抗炎、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮腦保護(hù)作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示，EP模型小鼠經(jīng)葛根素處理后，其癲癇發(fā)作次數(shù)減少，發(fā)作持續(xù)時間及平均逃避潛伏期縮短，腦組織MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平降低，穿越原平臺位置次數(shù)增加，SOD水平升高，表明葛根素可能通過抑制炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激水平，減輕小鼠癲癇發(fā)作，改善其認(rèn)知功能。

PI3K/Akt/GSK-3β信號可調(diào)控機(jī)體免疫炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞存活、凋亡等生理病理過程，增強(qiáng)該信號中相關(guān)蛋白磷酸化水平，可激活該通路，進(jìn)而抑制炎癥，下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)，減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷［18］。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路可提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，預(yù)防淀粉樣β誘導(dǎo)的記憶障礙［19］。另外，在HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的研究中發(fā)現(xiàn)，葛根素可增強(qiáng)PI3K/Akt/GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此推測，葛根素減輕EP癥狀的藥理機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/GSK-3β通路有關(guān)［20］。本文結(jié)果顯示，EP小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β明顯降低，以PI3K抑制劑LY294002處理后，小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)增加，發(fā)作持續(xù)時間及平均逃避潛伏期延長，穿越原平臺位置次數(shù)減少，表明PI3K/Akt/GSK-3β信號參與介導(dǎo)癲癇發(fā)作過程，抑制該通路可減輕癲癇癥狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素和LY294002聯(lián)合處理后，EP小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)減少，發(fā)作持續(xù)時間及平均逃避潛伏期縮短，腦組織MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平比LY294002組小鼠降低，但高于葛根素組，穿越原平臺位置次數(shù)增加、SOD水平比LY294002組小鼠升高，但低于葛根素組，表明可減弱葛根素阻止炎癥發(fā)生、降低氧化應(yīng)激水平、修復(fù)認(rèn)知功能、減輕癲癇癥狀的作用可被LY294002逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步提示葛根素可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，抑制EP小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕EP小鼠臨床癥狀。

綜上所述，葛根素可減輕EP小鼠腦部炎癥及氧化應(yīng)激損傷，改善其認(rèn)知功能，進(jìn)而減輕EP小鼠臨床癥狀，為EP的臨床治療提供了新思路，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路是其藥理機(jī)制之一。但本文只在整體層面進(jìn)行了初步探討，關(guān)于PI3K/Akt/GSK-3β信號下游調(diào)控神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制并未涉及，還存在一定不足，其更清楚完整的藥理機(jī)制還需后續(xù)深入研究。