翟占強(qiáng) 江立群 朱 佳 張典鈿 湯靈玲（浙江省榮軍醫(yī)院胸部疾病診療中心，嘉興314000）

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，近年來(lái)隨著環(huán)境惡化發(fā)病率不斷升高，已成為21世紀(jì)嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾?。?］。目前肺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，患者確診時(shí)多數(shù)已致中晚期，手術(shù)及放化療效果不佳，治療期間器官功能受損、腫瘤耐藥等不良反應(yīng)導(dǎo)致病死率居高不下［2-3］。因此，探討肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效治療靶點(diǎn)提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤生長(zhǎng)有積極意義。螺旋-環(huán)-螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域蛋白D2（helix-loop-helix topology protein D2，EFhD2）又稱Swiprosin-1，主要存在于人淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞［4］。近年來(lái)研究表明，EFhD2在免疫細(xì)胞激活、細(xì)胞毒作用、癌細(xì)胞增殖及遷移等多種生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但具體調(diào)控機(jī)制不明［5］。為此，本研究通過(guò)建立大鼠肺癌模型，觀察抑制或激活EFhD2蛋白的表達(dá)對(duì)肺癌大鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)控作用，并探討其調(diào)控機(jī)制，為臨床中肺癌靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠，75只，雌雄各37只、38只，8周齡，體重（180±20）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，使用許可證號(hào)SYXK（京）2019-0022。飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替、60%濕度、23～25℃溫度條件下，自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中符合減少、替代和優(yōu)化的3R原則。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：IACUC-20190101-02。

1.1.2 主要試劑與儀器 含EFhD2基因短發(fā)卡樣RNA（shRNA-EFhD2）和模擬物RNA（mimic-EFhD2）的重組腺病毒載體（病毒滴度1×1010PFU/ml，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序及病毒包裝）；三甲基膽蒽、二乙基亞硝胺（美國(guó)Sigma公司）；碘化油注射液（煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022398，規(guī)格10 ml）；CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（杭州安捷倫生物有限公司）；兔抗大鼠EFhD2、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transduction and transcription activator 3，STAT3）、p-STAT3單抗（美國(guó)Abcam公司）；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國(guó)Thermo Fisher公司）；FACSCalibur分析型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌模型建立75只大鼠隨機(jī)取60只采用氣管內(nèi)灌注致癌碘油液法建立大鼠肺癌模型，參考文獻(xiàn)［6］肺癌模型建立大鼠肺癌模型：造模前3 d肌注2萬(wàn)單位青霉素、50 mg鏈霉素預(yù)防肺部感染；60只Wister大鼠腹腔注射戊巴比妥那麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，額鏡直視下左肺支氣管灌注0.1 ml致癌碘油液（1.2 g三甲基膽蒽、1.6 ml二乙基亞硝胺與6.4 ml碘油混合后取0.1 ml），對(duì)照組同法灌注0.1 ml碘油。灌注結(jié)束后分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2.2 分組及干預(yù) 大鼠灌注成功后隨機(jī)分為模型 組、sh-EFhD2組、EFhD2組、EFhD2-AG490組，15只/組。其余15只大鼠采用同法灌注碘油，設(shè)為對(duì)照組。灌注成功后次日開(kāi)始干預(yù)：sh-EFhD2組、EFhD2組分別尾靜脈注射shRNA-EFhD2、mimic-EFhD2重組腺病毒載體（病毒滴度1×1010PFU/ml）100 μl，10 min后尾靜脈注射100 μl生理鹽水；EFhD2-AG490組尾靜脈注射100 μl mimic-EFhD2重組腺病毒載體后10 min，尾靜脈注射0.25 mg JAK2抑制劑AG490 100 μl；模型組和對(duì)照組尾靜脈注射等量生理鹽水；每周干預(yù)1次，共干預(yù)8周。干預(yù)期間觀察大鼠一般情況。本研究所有大鼠均進(jìn)行病理組織學(xué)檢查明確肺癌建模成功，未建模成功大鼠予以剔除。

1.2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 末次干預(yù)后24 h，2%戊巴比妥那腹腔麻醉各組大鼠，腹主動(dòng)脈采 血1 ml，取50 μl抗 凝 血，加 入 含10 μl CD3+、CD4+、CD8+單抗的離心管中，冰上孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，避光冰上繼續(xù)孵育10 min，加入PBS洗滌3次，3 000 r/min離心8 min，取沉淀，用2%多聚甲醛固定，PBS重懸后，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞分析儀分析T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比，并計(jì)算CD4+/CD8+。

1.2.4肺指數(shù)、脾臟指數(shù)計(jì)算及組織取材 各組于采血前稱取體重，采血結(jié)束后立即脫頸處死，解剖大鼠取肺、脾臟，以組織質(zhì)量/體重為肺指數(shù)和脾臟指數(shù)。各組取5只大鼠肺腫瘤組織置于10%中性甲醛固定備用，另取5只大鼠肺腫瘤組織置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 肺組織病理觀察 取置于10%中性甲醛固定24 h的肺腫瘤組織，梯度乙醇脫水、二甲苯固定后，進(jìn)行石蠟包埋及常規(guī)連續(xù)切片（厚度為5 μm），進(jìn)行常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病變情況。

1.2.6 EFhD2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)量檢測(cè) 取保存于-80℃的肺腫瘤組織約50 mg，加入液氮研磨，轉(zhuǎn)移至離心管，加入1 ml細(xì)胞裂解液，冰上孵育25 min，12 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm，取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量；取40 μg待測(cè)蛋白與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴8 min使蛋白變性，再次離心后取上清液，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBST洗滌10 min×3次，加入封閉液稀釋一抗［EFhD2（1∶500），JAK2、p-JAK2（1∶300），STAT3、p-STAT3（1∶500）］，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌10 min×3次，加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫繼續(xù)孵育1 h，于暗室中曝光、顯影，各條帶掃描拍照后，采用圖像分析軟件Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，多樣本資料比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模一般情況觀察 對(duì)照組大鼠試驗(yàn)期間進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等一般情況均正常；模型組于建模次日開(kāi)始進(jìn)食、飲水減少，喜臥、毛發(fā)無(wú)光澤等表現(xiàn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)呼吸加快、咳嗽增多并伴呼吸困難；EFhD2組上述癥狀和體征較模型組更為嚴(yán)重，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)多數(shù)處于垂死狀態(tài)；sh-EFhD2組上述癥狀和體征較模型組明顯減輕；EFhD2-AG490組上述癥狀和體征較模型組嚴(yán)重，但較EFhD2組減輕。

2.2 肺組織病理形態(tài)觀察 模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組、EFhD2-AG490組各有13、10、15、11只誘發(fā)肺鱗狀細(xì)胞癌，納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。模型組剩余2只為非典型增生，sh-EFhD2組剩余3只非典型增生、2只增生，EFhD2-AG490組剩余3只均非典型增生，1只增生。

對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病變；模型組支氣管黏膜上皮細(xì)胞磷狀化生，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，伴有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；sh-EFhD2組較模型組明顯減輕；EFhD2組上述病變較模型組更為嚴(yán)重，伴有肺泡囊擴(kuò)張，氣管黏膜充血，組織腫脹等；EFhD2-AG490組上述病變較EFhD2組減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織病理學(xué)染色（HE，×400，n=5）Fig.1 Pathological staining of lung histopathology（HE，×400，n=5）

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+比較 外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組CD3+、CD4+占比及CD4+/CD8+均降低，且CD3+、CD4+占比EFhD2組＜EFhD2-AG490組＜模型組＜sh-EFhD2組，CD4+/CD8+EFhD2組＜模型組和EFhD2-AG490組＜sh-EFhD2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相 比，模 型 組、sh-EFhD2組、EFhD2組 及EFhD2-AG490組CD8+占比升高，且EFhD2組＞模型組和EFhD2-AG490組＞sh-EFhD2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+比較（±s，%）Tab.1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD8+ratio and CD4+/CD8+（±s，%）

表1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+比較（±s，%）Tab.1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD8+ratio and CD4+/CD8+（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with sh-EFhD2 group，3）P＜0.05；compared with EFhD2 group，4）P＜0.05.

Groups Control Model sh-EFhD2 EFhD2 EFhD2-AG490 n 15 13 10 15 11 CD3+64.16±2.90 48.30±1.781）57.24±2.211）2）43.02±2.351）2）3）46.37±2.621）2）3）4）CD4+45.80±2.11 31.25±1.801）40.71±2.321）2）27.20±2.071）2）3）29.44±1.951）2）3）4）CD8+21.33±2.35 30.06±2.171）25.69±2.101）2）32.87±2.821）2）3）30.44±2.921）3）4）CD4+/CD8+2.15±0.13 1.04±0.091）1.58±0.111）2）0.83±0.091）2）3）0.97±0.101）3）4）

2.4 肺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 肺指數(shù)、脾臟指數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組肺指數(shù)較高，且EFhD2組＞模型組和EFhD2-AG490組＞sh-EFhD2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組脾臟指數(shù)較低，且EFhD2組＜模型組和EFhD2-AG490組＜sh-EFhD2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 肺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較（±s，mg/g）Tab.2 Comparison of lung index and spleen index（±s，mg/g）

表2 肺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較（±s，mg/g）Tab.2 Comparison of lung index and spleen index（±s，mg/g）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with sh-EFhD2 group，3）P＜0.05；compared with EFhD2 group，4）P＜0.05.

Groups Control Model sh-EFhD2 EFhD2 EFhD2-AG490 n 15 13 10 15 11 Lung index 2.94±0.56 5.87±0.711）4.06±0.621）2）6.55±0.701）2）3）6.02±0.511）3）4）Spleen index 4.93±0.40 2.24±0.391）2.95±0.381）2）1.80±0.271）2）3）2.07±0.301）3）4）

2.5 肺 組 織EFhD2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 肺組織EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；JAK2、STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，模 型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，且EFhD2組＞EFhD2-AG490組＞模型組＞sh-EFhD2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 肺組織EFhD2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況（±s，n=5）Fig.2 Lung tissue EFhD2，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein expressions（±s，n=5）

3 討論

肺癌發(fā)病因素較多，與年齡、環(huán)境暴露或腫瘤家族史等因素關(guān)系密切，隨著我國(guó)肺癌發(fā)病率和病死率的升高，對(duì)人們的健康危害逐漸加大，肺癌已被列為我國(guó)重點(diǎn)防治的癌癥之一［7-8］。近年來(lái)，盡管手術(shù)及放化療綜合治療手段已有長(zhǎng)足進(jìn)步，肺癌治療成功率有所提升，但仍有部分患者長(zhǎng)期預(yù)后不佳，尋找新的治療靶點(diǎn)有重要臨床意義。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，注射過(guò)表達(dá)EFhD2的黑色素瘤B16F10細(xì)胞小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)量和大小較對(duì)照組增多，而注射低表達(dá)EFhD2基因的B16F10細(xì)胞小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)量和大小較對(duì)照組顯著減少［9］，提示EFhD2基因下調(diào)有助于抗腫瘤，但對(duì)EFhD2在抗腫瘤過(guò)程中作用的機(jī)制研究尚少。

本研究顯示，模型組支氣管黏膜上皮細(xì)胞磷狀化生，伴有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組外周血CD3+、CD4+占比、CD4+/CD8+及脾臟指數(shù)較對(duì)照組降低，CD8+占比及肺指數(shù)升高（P＜0.05），說(shuō)明大鼠肺癌建模成功，且存在明顯免疫功能紊亂現(xiàn)象。本研究分別應(yīng)用低表達(dá)和過(guò)表達(dá)EFhD2的重組腺病毒載體干預(yù)后，sh-EFhD2組外周血CD3+、CD4+占比、CD4+/CD8+及脾臟指數(shù)升高，CD8+占比及肺指數(shù)降低（P＜0.05），而EFhD2組上述指標(biāo)較模型組更為嚴(yán)重，說(shuō)明低表達(dá)EFhD2可有效改善肺癌大鼠機(jī)體免疫功能。機(jī)體免疫反應(yīng)的激活受體或抑制受體對(duì)體內(nèi)外信號(hào)均有反應(yīng)，免疫細(xì)胞通過(guò)調(diào)控大量基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞因子、組織重塑酶等大量表達(dá)［10-11］。研究顯示，EFhD2在單核細(xì)胞系、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)，外源性刺激單核細(xì)胞可增強(qiáng)其抗原遞呈能力，進(jìn)而增強(qiáng)CD8+免疫應(yīng)答反應(yīng)［12］。KIM等［13］研究顯示，多種免疫細(xì)胞中，EFhD2在CD8+T細(xì)胞中表達(dá)量最高，EFhD2可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗原激發(fā)T細(xì)胞活化的晚期發(fā)揮免疫調(diào)控作用。

本研究顯示，模型組大鼠肺組織EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，提示肺癌大鼠JAK2/STAT3信號(hào)通路激活，與WANG等［14］的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步應(yīng)用低表達(dá)和過(guò)表達(dá)EFhD2的重組腺病毒載體干預(yù)后，sh-EFhD2組EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白降低，EFhD2組較模型組更高（P＜0.05），提示抑制EFhD2表達(dá)可抑制JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化激活；而應(yīng)用JAK2通路抑制劑AG490干預(yù)后，EFhD2及JAK2/STAT3信號(hào)通路較EFhD2組降低，且機(jī)體免疫功能得到改善，提示EFhd2可能通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控機(jī)體免疫功能的作用。JAK/STAT信號(hào)通路在多種腫瘤中被激活，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)過(guò)程，是目前研究的熱點(diǎn)腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路［15-16］。研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路與癌細(xì)胞免疫逃避關(guān)系密切，STAT高表達(dá)可抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的應(yīng)答，從而介導(dǎo)機(jī)體先天性或獲得性免疫反應(yīng)［17-18］。LIU等［19］研究表明，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路可通過(guò)降低腫瘤微環(huán)境中的髓源性抑制細(xì)胞抑制癌細(xì)胞免疫逃逸作用，從而減少腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。上述研究均說(shuō)明JAK2/STAT3信號(hào)通路在介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮重要作用。ZHANG等［20］研究顯示，EFhD2可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞γ-干擾素受體的表達(dá)調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，從而在膿毒癥巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用，與本研究中EFhD2參與肺癌大鼠免疫功能的調(diào)控機(jī)制相符，而本研究進(jìn)一步采用JAK2通路抑制劑開(kāi)展挽回實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了本研究的結(jié)論，提示EFhD2可能通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控機(jī)體免疫功能的作用。

綜上所述，抑制EFhD2蛋白表達(dá)可增強(qiáng)肺癌大鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能，可能通過(guò)抑制JAK2、STAT3蛋白磷酸化發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床中肺癌細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)提供了潛在的治療靶點(diǎn)。