劉榮濤，張?jiān)娧?，黃興文，朋小康，閔永剛，2

（1廣東工業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州 510006；2東莞華南設(shè)計(jì)創(chuàng)新院，廣東東莞 523808）

聚苯胺（PANI）因?yàn)榱己玫募庸ば?、?yōu)良的導(dǎo)電性和生物相容性被認(rèn)為是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的潛在候選材料[1-3]。許多研究表明電刺激下PANI能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞附著、增殖、遷移和分化[4-6]。但PANI在體液環(huán)境下（pH=7.4）會(huì)發(fā)生脫摻雜，使其導(dǎo)電性極大地減弱[7]，不能很好地發(fā)揮自身的電活性優(yōu)勢(shì)，從而使得PANI基可降解納米纖維在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化方面的應(yīng)用受到一定限制。然而，大量文獻(xiàn)表明，無(wú)外加電場(chǎng)下PANI基導(dǎo)電可降解納米纖維仍具有良好的生物相容性[8-9]，并且不同類(lèi)型酸摻雜劑得到的PANI基導(dǎo)電可降解納米纖維增強(qiáng)生物相容性效果也表現(xiàn)出差異[10-11]，這種現(xiàn)象可能是由不同PANI形貌對(duì)細(xì)胞活性的影響產(chǎn)生的。

本文將靜電紡絲法得到的聚乳酸納米纖維等離子體處理后，選擇酒石酸作為PANI原位氧化聚合過(guò)程中的酸摻雜劑，考察酒石酸與苯胺單體不同摩爾比下PANI/PLA復(fù)合納米纖維生物相容性表現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

苯胺（AN）、過(guò)硫酸銨（APS）、DL-酒石酸，Sigma Aldrich公司；聚乳酸（PLA，Mw=60000），上海阿拉丁試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸緩沖液（PBS），Biosharp，北京Labgic科技公司；低糖DMEM培養(yǎng)基，Gibco，美國(guó)Thermo Scientific公司；胎牛血清（FBS）、堿基磷酸酶（ALP），中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；MTT噻唑藍(lán)，德國(guó)Bioforx公司；FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，北京Solarbio科技公司。

靜電紡絲機(jī)，DP-30型，天津云帆科技公司；等離子體清洗機(jī)，PCE-6型，美國(guó)MTI公司；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），Niconlet iS50型，美國(guó)Thermo Scientific公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM），Hitachi-SU8220型，日本日立公司；接觸角分析儀，OCA 15 plus型，德國(guó)；酶標(biāo)儀，Synergy HTX型，美國(guó)BioTek公司；共聚焦顯微鏡，A1型，日本尼康公司。

1.2 PLA靜電紡絲納米纖維制備

一定質(zhì)量的PLA顆粒加入在DCM和DMF（質(zhì)量比為7∶3）混合液中，攪拌直到溶解，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PLA混合溶液。將PLA溶液裝入注射器中，連接高壓電源，設(shè)置電壓15kV、距離15cm。

1.3 酒石酸摻雜聚苯胺/聚乳酸復(fù)合納米纖維的制備

將酒石酸與苯胺單體分別按照1∶1、1∶2和1∶4的摩爾比溶解在40mL去離子水中，冰浴下攪拌1h，將等離子體（plasma）處理的PLA納米纖維浸入在上述混合溶液中。然后將與苯胺相同物質(zhì)的量的APS溶解在10mL去離子水中，冰浴下攪拌30min充分溶解后，逐滴加入到酒石酸與苯胺的混合溶液中，持續(xù)攪拌反應(yīng)24h，取出纖維薄膜后無(wú)水乙醇清洗，40℃真空干燥8h。將酒石酸與苯胺單體摩爾比為1∶1、1∶2和1∶4得到的聚苯胺記為PT1、PT2和PT4，對(duì)應(yīng)得到的PANI/PLA復(fù)合納米纖維標(biāo)記為PLT1、PLT2和PLT4。靜電紡絲納米纖維和PANI/PLA復(fù)合納米纖維的制備過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 PLA靜電紡絲納米纖維和PANI/PLA復(fù)合納米纖維制備

1.4 PANI/PLA復(fù)合納米纖維支架的表征

通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察不同摩爾比酒石酸摻雜的PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面形貌和結(jié)構(gòu)。為了確定PANI完全負(fù)載在PLA納米纖維上，對(duì)制備的PANI/PLA復(fù)合納米纖維進(jìn)行FTIR測(cè)量。通過(guò)接觸角實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)PANI/PLA復(fù)合納米纖維支架的潤(rùn)濕性。

1.5 PANI/PLA復(fù)合納米纖維生物相容性表征

采用人骨肉瘤細(xì)胞（HOS，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）活性作為生物相容性指標(biāo)。HOS細(xì)胞在含有10%FBS、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞增殖試驗(yàn)開(kāi)始之前需要將HOS細(xì)胞接種在PANI/PLA復(fù)合納米纖維上。將PANI/PLA復(fù)合納米纖維放入96孔板中，完全覆蓋培養(yǎng)板底部，紫外殺菌30min，以3×104每孔的密度接種到PANI/PLA復(fù)合納米纖維上，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組，孵育1天、3天、5天，每隔2天更換培養(yǎng)基。

用細(xì)胞增殖檢測(cè)（MTT）法檢測(cè)PANI/PLA復(fù)合納米纖維細(xì)胞活性。堿基磷酸酶活性（ALP）采用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒方法測(cè)定。細(xì)胞熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞膜外肌動(dòng)蛋白，使用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 PANI與PANI/PLA復(fù)合納米纖維性能

2.1.1 表面形貌

圖2為不同酒石酸和苯胺摩爾比得到的PANI和對(duì)應(yīng)PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面形貌。從圖2(a)可以看出，酒石酸和苯胺摩爾比為1∶1時(shí)的PT1形貌為納米顆粒；摩爾比為1∶2時(shí)的PT2形貌主要為納米纖維；摩爾比為1∶4時(shí)PT4呈現(xiàn)出明顯的納米空心管狀纖維結(jié)構(gòu)，表面有明顯的小毛刺。為進(jìn)一步觀察PANI納米纖維的結(jié)構(gòu)，通過(guò)TEM表征酒石酸和苯胺摩爾比為1∶2和1∶4得到的PANI納米結(jié)構(gòu)（圖3）。從圖3可以看出，酒石酸與聚苯胺摩爾比為1∶2的聚苯胺（PLT2）為實(shí)心納米纖維，而酒石酸與聚苯胺摩爾比為1∶4的聚苯胺（PLT4）有明顯的空心管狀結(jié)構(gòu)，這與SEM結(jié)果表現(xiàn)一致。圖2(b)所示為對(duì)應(yīng)的PANI/PLA復(fù)合納米纖維SEM圖，可以看出不同酒石酸和苯胺摩爾比的PANI主要是覆蓋在PLA納米纖維表面，形貌與對(duì)應(yīng)的純PANI表現(xiàn)一致，酒石酸摻雜的PANI/PLA復(fù)合納米纖維仍能保持良好的纖維形貌和多孔纖維結(jié)構(gòu)。SEM結(jié)果表明，酒石酸摻雜的PANI成功負(fù)載在PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面。

圖2 不同酒石酸和苯胺摩爾比的PANI形貌和對(duì)應(yīng)的PANI/PLA納米纖維形貌

圖3 酒石酸與聚苯胺摩爾比為1∶2和1∶4的聚苯胺TEM圖

在酒石酸作為摻雜劑生成PANI過(guò)程中，酒石酸作為模板附著在PLA納米纖維表面，氧化劑存在下，苯胺分子在酒石酸表面聚合產(chǎn)生的苯胺低聚物，進(jìn)而相互連接形成PANI納米纖維[12]。反應(yīng)體系中酒石酸濃度過(guò)低時(shí)，不足以使苯胺低聚物相互連接，因此得到的PANI形貌多表現(xiàn)為納米顆?；蚨贪魻頪13-14]。酒石酸濃度增加，使得苯胺低聚物相互連接的過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行，生成PANI納米纖維狀和空心納米管狀結(jié)構(gòu)[15]。與顆粒狀PANI相比，納米纖維狀PANI表現(xiàn)出更強(qiáng)的分子排列有序性，分子鏈規(guī)整性好，并且納米管狀結(jié)構(gòu)PANI具有更大的比表面積[16-17]。

2.1.2 表面成分分析

通過(guò)FTIR說(shuō)明PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面組成，不同酒石酸和苯胺摩爾比的PANI和PANI/PLA復(fù)合納米纖維的FTIR如圖4。在純摻雜PANI的FTIR圖 譜 中[圖4(a)]，1568cm-1、1492cm-1、1298cm-1和1141cm-1的峰分別對(duì)應(yīng)醌環(huán)伸縮、苯環(huán)C==C伸縮、苯環(huán)C—N伸縮和==CH伸縮[18]。在PANI/PLA復(fù)合納米纖維FTIR圖譜中[圖4(b)]，除了PANI的特征峰外，還可以看到PLA特征峰，分別為1092cm-1和1184cm-1代表的C—O伸縮振動(dòng)峰，1757cm-1代表的C==O伸縮振動(dòng)峰[19]。結(jié)果表明，酒石酸摻雜的PANI能夠在PLA納米纖維表面成功負(fù)載。

圖4 酒石酸與苯胺摩爾比為1∶1、1∶2和1∶4的聚苯胺及對(duì)應(yīng)聚苯胺/聚乳酸復(fù)合納米纖維FTIR圖譜

2.1.3 接觸角分析

支架的潤(rùn)濕性影響細(xì)胞的黏附、遷移和增殖[20-21]，通常通過(guò)材料與水的接觸角來(lái)評(píng)價(jià)。在室溫下，將50μL去離子水滴在納米纖維表面，每種納米纖維取3個(gè)樣品，取3次測(cè)試接觸角的平均值。圖5所示為水滴在1s內(nèi)與納米纖維膜上的接觸角?？梢钥闯?，經(jīng)過(guò)plasma處理的PANI/PLA復(fù)合納米纖維的接觸角明顯減小。對(duì)應(yīng)的PLT1、PLT2和PLT4的接觸角分別為76.3°、64.3°和61.4°，與PLA接觸角為（111.2°）相比，分別降低了34.9°、46.9°和49.8°，納米顆粒狀形貌PANI的PLT1減小最少，納米纖維的PANI的PLT2和PLT4減少的較多。不同PANI形貌增加了PANI/PLA體系的表面能，納米纖維的取向結(jié)構(gòu)有助于水分子的擴(kuò)散，而管狀結(jié)構(gòu)增加了接觸面積，使得接觸面積增加。在實(shí)際測(cè)試過(guò)程中，觀察到納米纖維初始與水接觸時(shí)，表現(xiàn)出不同的接觸角，與水接觸5s后，接觸角變?yōu)?°，表現(xiàn)出良好的親水性[22]。這是因?yàn)榻?jīng)plasma處理后，PLA納米纖維表面會(huì)產(chǎn)生親水含氧基團(tuán)（如—OH、—COOH等），與酒石酸摻雜原位聚合的PANI共同作用，最終使PANI/PLA復(fù)合納米纖維完全濕潤(rùn)，表現(xiàn)出良好的親水性[23]。

圖5 PLA納米纖維和不同酒石酸與苯胺摩爾比得到的PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面接觸角

2.2 靜電紡絲納米纖維的生物相容性

生物支架材料除自身具有一定的力學(xué)性能和一定的降解性外，最重要的是能促進(jìn)細(xì)胞在表面的黏附、生長(zhǎng)和增殖，即要具有一定的生物相容性[24]。通過(guò)HOS在PLA和PANI/PLA復(fù)合納米纖維上細(xì)胞活性表征生物相容性，堿性磷酸酶活性的高低反映成骨細(xì)胞活性及狀態(tài)，細(xì)胞免疫熒光染色觀察細(xì)胞肌動(dòng)蛋白狀態(tài)說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)黏附狀態(tài)。

圖6和圖7分別為接種在PLA和PANI/PLA復(fù)合納米纖維上的HOS細(xì)胞培養(yǎng)1天、3天、5天后的細(xì)胞活性和孵育7天的細(xì)胞ALP活性?？梢钥闯?，PLA和PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面細(xì)胞活性逐漸提高，PANI/PLA復(fù)合納米纖維細(xì)胞活性和7天的ALP活性高于對(duì)照組PLA納米纖維，細(xì)胞活性和ALP活性順序?yàn)镻LT4>PLT2>PLT1。從潤(rùn)濕性角度分析，PANI/PLA復(fù)合納米纖維都表現(xiàn)出良好的親水性，因此對(duì)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)沒(méi)有影響差異。能夠影響細(xì)胞活性和ALP活性的只有酒石酸與苯胺摩爾比不同形成的不同形貌的PANI，從這點(diǎn)來(lái)看，納米纖維狀的PLT2和PLT4生物相容性要強(qiáng)于納米顆粒狀形貌的PLT1，并且具有納米空心管狀結(jié)構(gòu)的PLT4表現(xiàn)最好。

圖6 在PLA納米纖維和PANI/PLA復(fù)合納米纖維上培養(yǎng)1天、3天和5天細(xì)胞活性

這是因?yàn)镻LA納米纖維表面附著的PANI能夠增加體系的接觸位點(diǎn)和極性，更有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，特別是納米纖維狀形貌的PANI具有較高的有序度和取向，更利于細(xì)胞黏附和遷移，空心管狀納米纖維結(jié)構(gòu)提供了更大的接觸面積和表面能，使得細(xì)胞更傾向于在其表面黏附和生長(zhǎng)，從而表現(xiàn)出更加優(yōu)異的生物相容性[16,25]。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論，圖8中可以看到肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞形態(tài)在不同納米纖維表面的狀態(tài)。HOS細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白束在PLA和PANI/PLA復(fù)合納米纖維上皆表現(xiàn)出良好伸展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度表現(xiàn)與細(xì)胞活性和ALP活性結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，酒石酸摻雜的PANI/PLA復(fù)合納米纖維具有良好的生物相容性，不同酒石酸和苯胺摩爾比得到的PANI形貌對(duì)PANI/PLA復(fù)合納米纖維生物相容性增強(qiáng)表現(xiàn)有所不同，納米纖維狀的PANI對(duì)生物相容性的增強(qiáng)效果明顯優(yōu)于納米顆粒狀PANI，而具有空心管狀結(jié)構(gòu)的PANI對(duì)生物相容性增強(qiáng)作用更優(yōu)。

圖8 HOS細(xì)胞在PLA納米纖維和不同酒石酸與苯胺摩爾比得到的PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面培養(yǎng)24h后細(xì)胞免疫熒光染色顯微圖像

3 結(jié)論

選擇酒石酸作為PANI/PLA復(fù)合納米纖維制備過(guò)程中的酸摻雜劑，考察了不同酒石酸與苯胺單體摩爾比下PANI形貌的不同對(duì)生物相容性的影響，得到如下結(jié)論。

（1）酒石酸摻雜的PANI附著在PLA納米纖維表面，不會(huì)對(duì)靜電紡絲的多孔結(jié)構(gòu)基體產(chǎn)生影響。

（2）PANI/PLA復(fù)合納米纖維表面親水性初始親水性因PANI形貌不同而有所區(qū)別，但5s后能夠完全潤(rùn)濕。

（3）納米纖維狀的PANI對(duì)生物相容性的增強(qiáng)效果明顯優(yōu)于納米顆粒狀PANI，而具有空心管狀結(jié)構(gòu)的PANI對(duì)生物相容性增強(qiáng)作用更優(yōu)。

選擇對(duì)pH不敏感的導(dǎo)電高分子，通過(guò)改變外加酸摻雜劑與單體的比例調(diào)控導(dǎo)電高分子形貌，在外加電場(chǎng)配合下，可以更好地促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和組織的修復(fù)，滿足在組織工程的實(shí)際需要。