李少華，張鐵山，邢克炎，何新莊，李玉偉

1.永煤集團(tuán)總醫(yī)院骨科，商丘 476600

2.漯河市中心醫(yī)院骨科，漯河 462000

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)退化和骨脆性增加為特點的骨代謝疾病［1-2］。正常的骨代謝是一種由成骨細(xì)胞產(chǎn)生新骨組織和破骨細(xì)胞吸收舊骨組織構(gòu)成的動態(tài)平衡［3］。成骨細(xì)胞的分化涉及多種轉(zhuǎn)錄因子，如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Osx）、骨鈣素（Ocn）和轉(zhuǎn)錄激活因子4（ATF4）等。有研究［4］顯示，ATF4基因敲除小鼠失去形成成熟骨架的能力。在成骨細(xì)胞中，ATF4通過與ATF3結(jié)合，促進(jìn)下游C/EBP 同源蛋白（CHOP）的表達(dá)，從而影響骨形成［5］。CHOP是骨骼發(fā)育的必需因子，有研究［6］發(fā)現(xiàn)其可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）相互作用，但CHOP的過表達(dá)會使骨組織受損。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是細(xì)胞內(nèi)的一種重要防御機(jī)制［7］，主要通過未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）發(fā)揮作用，而UPR主要的經(jīng)典通路包括雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）/ATF6/肌醇需求酶1（IRE1）［8］。在骨代謝過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要［9-10］。既往研究［11-13］證明，ERS與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，但ERS過度導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制仍不清楚。本研究通過ERS通路激動劑衣霉素（TM）模型和ATF4過表達(dá)模型，研究ATF4在ERS導(dǎo)致骨質(zhì)疏松中的調(diào)控作用，為臨床防止ERS過度導(dǎo)致骨質(zhì)疏松提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

雌雄2對ATF4過表達(dá)雜合子C57BL/6J小鼠由美國Jackson實驗室提供（貨號：013072）。小鼠進(jìn)行擴(kuò)增繁殖后，通過鼠尾裂解法在新生小鼠中篩選出ATF過表達(dá)純合子小鼠和野生型小鼠，待小鼠生長至12周齡即可進(jìn)行下一步實驗。戊巴比妥（生工生物工程股份有限公司，上海）；TM（Selleck生物科技有限公司，美國）；4%多聚甲醛溶液（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）；TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；PCR試劑盒（寶生物工程有限公司，大連）；RIPA裂解液和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）；BCA試劑（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Runx2、Osx、Ocn、ATF4、CHOP和GAPDH抗體（Santa Cruz公司，美國）；二抗（賽信通生物試劑有限公司，上海 ）；SDS-PAGE試劑（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；超敏型ECL發(fā)光液（四正柏生物科技有限公司，北京）。

1.2 動物分組與模型建立

實驗小鼠分為4組，每組10只。對照野生組：野生型小鼠鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 μL。TM野生組：野生型小鼠鼠尾靜脈注射0.2 μL ERS通路激動劑TM（1 mg/kg）。ATF4過表達(dá)純合子組（ATF4+/+組）：ATF4過表達(dá)純合子小鼠鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 μL。TM干預(yù)ATF4過表達(dá)純合子組（TM ATF4+/+組）：ATF4過表達(dá)純合子小鼠鼠尾靜脈注射0.2 μL TM（1 mg/kg）。干預(yù)周期為6周。

1.3 影像學(xué)分析

干預(yù)6周后，采用2%戊巴比妥鈉將各組小鼠麻醉后，迅速剝離小鼠左股骨，用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，換取新4%多聚甲醛溶液。將固定的股骨擦干，使用小動物顯微影像系統(tǒng)（microCT，Hiscan XM）進(jìn)行檢測。掃描條件：60 kV，133 μA，單次曝光時間1.2 s，掃描分辨率9 μm，掃描角度間隔0.5°，掃描360°。待掃描成功后，拷貝文件，采用重建軟件Hiscan Reconstruct software和分析軟件Hiscan Analyzer software進(jìn)行分析。分析小鼠股骨骨密度（BMD）、骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)（Tb.BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁間隔（Tb.Sp）。

1.4 蘇木精-伊紅（HE）染色

所有小鼠的左股骨microCT掃描完成后，放入4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24 h。用14% EDTA溶液脫鈣14 d，常規(guī)脫蠟、包埋、石蠟切片，切片厚度為3～4 μm。用蘇木精溶液染色1 min，流水沖洗5 min；0.5%伊紅染色3 min，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Image J軟件計算骨小梁相對面積。

1.5 成骨相關(guān)蛋白和CHOP的表達(dá)檢測

將小鼠的右股骨迅速剝離后，放入EP管中，于-20℃保存。分別取各組5只小鼠的右股骨用液氮碾磨至粉末后，使用RIPA緩沖液提取骨組織中總蛋白。利用BCA試劑檢測蛋白質(zhì)總濃度后將其變性，保存于-20℃冰箱，以備蛋白質(zhì)印跡檢測。取出骨組織總蛋白，采用SDS-PAGE分離蛋白條帶，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 ～ 2 h后，再用TBST洗滌3次，每次10 min。然后將膜放入以1∶1 000稀釋的一抗（Runx2、Osx、Ocn、ATF4、CHOP和GAPDH抗體）中，4℃ 孵育10 h以上。再用TBST洗滌3次后，加入以1∶4 000稀釋的相應(yīng)二抗中，室溫孵育2 h。TBST 洗滌3次，每次10 min。將超敏ECL發(fā)光液滴在膜上，立即放入化學(xué)發(fā)光成像儀（Invitorgen公司，美國）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。通過Image J軟件分析結(jié)果，以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化目的蛋白為相對表達(dá)量。

1.6 成骨相關(guān)基因和CHOP的表達(dá)檢測

取各組剩余的5只小鼠右股骨用液氮碾磨至粉末后，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA。用分光光度計檢測RNA的純度和濃度后，將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)（ABI公司，美國）上進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。引物序列：Runx2正 鏈 引 物5'-GTACTAGCTTAACGTA-3'，反鏈引物5'-GATCAGGTAACAATCA-3'；Osx正鏈引物5'-AGTCACCGTACCCATG-3'，反鏈引物5'-GTAACGTACGTAAAGTCC-3'；Ocn正鏈引物5'-GCTAGGTCAAGTCAATCAA-3'，反 鏈 引 物5'- GTAACGTAACCCGTAT-3'；ATF4正鏈引物5'-CTAGACTAGTTCAGATTCCA-3'，反 鏈 引 物5'-AGTCTTATTAGTCAGGTCA-3'；CHOP正 鏈引物5’-TGATCGTGGTAACTAATT-3'，反鏈引物5'-TGATGCATTAGCTAGAAT-3'；GAPDH正鏈引物5'-AGTCGTTACGTACCGT-3'，反鏈引物5'-TAGTCA GTAAGGTCATATT-3'。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s、60℃ 50 s、72℃ 35 s，38個循環(huán)。GAPDH作為mRNA的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，基因表達(dá)結(jié)果均以2-△△ct進(jìn)行統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ATF4在各組小鼠的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡檢測和實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照野生組比較，其他3組小鼠股骨中ATF4蛋白和基因表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖1）。與TM野生組和ATF4+/+組比較，TM ATF4+/+組的ATF4蛋白和基因表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖1）。

圖1 4組小鼠股骨中ATF4蛋白和基因表達(dá)Fig. 1 Expression of ATF4 protein and gene in femur of 4 group mice

2.2 小鼠股骨影像學(xué)結(jié)果

MicroCT結(jié)果顯示，與對照野生組相比，其他3組小鼠股骨BMD、Tb.BV/TV和Tb.N降低，Tb.Sp升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表1，圖2）。與TM野生組和ATF4+/+組相比，TM ATF4+/+組小鼠的BMD、Tb.BV/TV和Tb.N降低，Tb.Sp升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表1，圖2）。

圖2 4組小鼠股骨microCT掃描三維重建Fig. 2 MicroCT three-dimensional reconstruction of femur in 4 group mice

表1 4組小鼠骨密度相關(guān)指標(biāo)Tab. 1 Related indexes of bone mineral density of 4 group mice n=10，±s

表1 4組小鼠骨密度相關(guān)指標(biāo)Tab. 1 Related indexes of bone mineral density of 4 group mice n=10，±s

注：*與對照野生組比較，P ＜ 0.05；△與TM野生組和ATF4+/+組比較，P ＜ 0.05。Note：* P ＜ 0.05，compared with control wild group；△P ＜ 0.05，compared with TM wild group and ATF4+/+ group.

組別Group BMD/（g·cm-3） Tb.BV/TV Tb.N/mm-1 Tb.Sp/μm對照野生Control wild862.90±7.86 7.30±1.01 2.133±0.402 0.19±0.03 TM野生TM wild 445.50±12.15* 3.15±0.89* 1.113±0.310* 0.41±0.05*ATF4+/+ 392.70±6.09* 3.22±0.45* 1.213±0.310* 0.37±0.04*TM ATF4+/+ 301.60±10.22*△1.16±0.52*△0.623±0.102*△0.52±0.04*△

2.3 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，對照野生組小鼠股骨干骺端鏡下骨小梁呈網(wǎng)狀，排列整齊，骨微結(jié)構(gòu)完整。與對照野生組小鼠相比，其他3組小鼠股骨干骺端骨小梁變細(xì)，結(jié)構(gòu)斷裂混亂，骨小梁數(shù)量減少；并且骨小梁相對面積減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。與TM野生組和ATF4+/+組小鼠相比，TM ATF4+/+組的股骨干骺端骨小梁更加細(xì)小，骨小梁數(shù)量明顯減少，骨髓腔間隙變大；并且骨小梁相對面積減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖3）。

圖3 4組小鼠股骨HE染色結(jié)果Fig. 3 HE staining results of femur in 4 group mice

2.4 成骨相關(guān)因子表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡分析和實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照野生組比較，其他3組小鼠的成骨相關(guān)因子Runx2、OSX、Ocn的蛋白和基因表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4）。與TM野生組和ATF4+/+組比較，TM ATF4+/+組的Runx2、Osx、Ocn蛋白和基因表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4）。

圖4 4組小鼠股骨中成骨相關(guān)因子蛋白和基因表達(dá)Fig. 4 Protein and gene expressions of bone formation related factors of femur in 4 group mice

2.5 CHOP表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡分析和實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照野生組比較，其他3組小鼠CHOP的蛋白和基因表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖5）。與TM野生組和ATF4+/+組比較，TM ATF4+/+組的CHOP的蛋白和基因表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖5）。

圖5 4組小鼠股骨中CHOP蛋白和基因表達(dá)Fig. 5 Protein and gene expressions of CHOP of femur in 4 group mice

3 討 論

ERS是一種細(xì)胞自我保護(hù)反應(yīng)，適度的應(yīng)激可減輕損傷，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，但過度或長期的應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［14］。在骨代謝過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，一方面，輕度的ERS通過促進(jìn)Runx2等成骨因子表達(dá)維持骨內(nèi)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生長及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，并抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生［9］；另一方面，在高強(qiáng)度長時間的應(yīng)激狀態(tài)下，骨內(nèi)多種信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加速骨鈣丟失［10］。ERS相關(guān)基因參與骨骼細(xì)胞的生長和分化，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要因素之一［15］。

ATF4是ERS影響成骨細(xì)胞增殖分化和骨代謝過程的重要因素［6］。ERS通過磷酸化eIF2α促進(jìn) ATF4的轉(zhuǎn)錄，從而激活CHOP信號通路［16］。在ERS過度狀態(tài)下，ATF4/CHOP途徑被激活，可促進(jìn)Bax、Caspase等凋亡信號分子大量生成，進(jìn)而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，抑制成骨分化，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨發(fā)育不全等一系列病理過程［17］。

基于以上研究基礎(chǔ)，本研究通過構(gòu)建體內(nèi)模型探討ATF4過表達(dá)在ERS所導(dǎo)致骨質(zhì)疏松中的作用，以及ATF4/CHOP信號通路的變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATF4在骨質(zhì)疏松小鼠骨組織中表達(dá)上調(diào)；激活小鼠骨組織的ERS后，ATF4表達(dá)增加，而骨相關(guān)因子和骨密度均降低；進(jìn)一步使ATF4過表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)其能抑制小鼠骨代謝，導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)疏松。實驗證明，ATF4可通過ATF4/CHOP信號通路參與ERS進(jìn)而導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)疏松。

綜上所述，ERS可能通過促進(jìn)ATF4過表達(dá)激活CHOP 信號通路，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。因此，ATF4/CHOP信號通路的激活可能對骨質(zhì)疏松的發(fā)生有重要意義。本研究為動物實驗，更具體的分子機(jī)制仍需通過體外實驗進(jìn)一步驗證。