高麗紅

（山西省呂梁市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山西 呂梁 033000）

盆底功能障礙是指因盆底支持組織退化、損傷及功能障礙所導(dǎo)致的一組疾病，包括壓力性尿失禁、盆腔臟器脫垂、性功能障礙等。有報道稱，我國女性盆底功能障礙的發(fā)病率高達(dá)40%～60%[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，生物力學(xué)與盆底功能障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。成纖維細(xì)胞是組成女性盆底支持系統(tǒng)的重要成分之一，其通過感知應(yīng)力能調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的合成，從而起到維持盆底結(jié)締組織結(jié)構(gòu)與功能的作用[2]。本文主要是探討雌激素對盆底功能障礙患者陰道壁成纖維細(xì)胞力學(xué)反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月期間在我院進(jìn)行手術(shù)治療的10例盆底功能障礙患者作為研究對象。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：性別為女性；具有進(jìn)行手術(shù)治療的指征；術(shù)前3個月內(nèi)未應(yīng)用過激素類藥物；自愿參與本研究。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：合并有結(jié)締組織病或其他嚴(yán)重的婦科疾??；病歷資料缺失；存在認(rèn)知功能障礙。這些患者的年齡為55～60歲，平均年齡為（57.25±5.14）歲；其中，子宮脫垂患者有6例，壓力性尿失禁患者有4例。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，免疫組化試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄酶，TRIzol試劑，Oligo （dT）18引物、Flexercell4000細(xì)胞加載系統(tǒng)，DNA擴(kuò)增儀，酶標(biāo)儀，Alpha凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 術(shù)后取患者的陰道壁組織塊進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，細(xì)胞融合后傳代培養(yǎng)12代。制備細(xì)胞爬片，取原代培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行水浴加熱處理，修復(fù)抗原，并進(jìn)行免疫染色。

1.2.3 應(yīng)力刺激 將3～5代對數(shù)期成纖維細(xì)胞接種在培養(yǎng)板上，每孔含4 mL的培養(yǎng)基、5×104個成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)后，將其分為靜態(tài)組和應(yīng)力組。對靜態(tài)組成纖維細(xì)胞不進(jìn)行應(yīng)力刺激處理，對應(yīng)力組成纖維細(xì)胞加載外力進(jìn)行應(yīng)力刺激。應(yīng)力刺激的條件是：正弦波，頻率為0.3 Hz，牽拉10%，時間為12 h。

1.2.4 雌激素干預(yù)實驗 卸載外力后，將應(yīng)力組成纖維細(xì)胞分為空白對照組（空白組）、無水乙醇溶媒空白組（溶媒組）和雌激素干預(yù)組（雌激素組）。在溶媒組成纖維細(xì)胞中加入10-8mol/L的無水乙醇，在雌激素組成纖維細(xì)胞中加入10-8mol/L無水乙醇與17β-雌二醇配置成的溶液，對空白組不做處理。完成上述操作后，將各組成纖維細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 擴(kuò)增反應(yīng) 采用Trizol法提取各組成纖維細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：反應(yīng)體系為20μL，65℃下反應(yīng)5 min，42℃下反應(yīng)60 min，70℃下反應(yīng)5 min。之后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：反應(yīng)體系為25μL，95℃下反應(yīng)2 min，95℃下反應(yīng)40 s，52℃下反應(yīng)40 s，72℃下反應(yīng)60 s，循環(huán)30次，72℃下反應(yīng)5 min。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.3 觀察指標(biāo)

觀察應(yīng)力刺激下盆底功能障礙患者陰道壁成纖維細(xì)胞的形態(tài)改變。 比較靜態(tài)組成纖維細(xì)胞與應(yīng)力組成纖維細(xì)胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平。比較空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細(xì)胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)力刺激下陰道壁成纖維細(xì)胞的形態(tài)改變

盆底功能障礙患者的陰道壁成纖維細(xì)胞在受到應(yīng)力刺激前呈多角形或梭形排列，無明顯的方向性；受到應(yīng)力刺激后，陰道壁成纖維細(xì)胞呈長梭形排列，排列較規(guī)則，且排列方向多垂直于應(yīng)力方向。

2.2 靜態(tài)組成纖維細(xì)胞與應(yīng)力組成纖維細(xì)胞中各指標(biāo)表達(dá)水平的比較

與靜態(tài)組成纖維細(xì)胞相比，應(yīng)力組成纖維細(xì)胞中ColⅠmRNA、MMP-1mRNA的表達(dá)水平均更高，Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平均更低，P＜0.05。詳見表2。

表2 靜態(tài)組成纖維細(xì)胞與應(yīng)力組成纖維細(xì)胞中各指標(biāo)表達(dá)水平的比較（%，±s ）

表2 靜態(tài)組成纖維細(xì)胞與應(yīng)力組成纖維細(xì)胞中各指標(biāo)表達(dá)水平的比較（%，±s ）

組別 Col ⅠmRNA Col ⅢmRNAMMP-1mRNA TIMP-1mRNA靜態(tài)組（n=10）1.062±0.047 0.592±0.128 1.310±0.139 1.431±0.392應(yīng)力組（n=10）1.252±0.059 0.103±0.017 1.655±0.197 1.035±0.061 t值 7.965 11.975 4.525 3.157 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.006

2.3 空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細(xì)胞中各指標(biāo)表達(dá)水平的比較

與空白組成纖維細(xì)胞及溶媒組成纖維細(xì)胞相比，雌激素組成纖維細(xì)胞中Col ⅠmRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平均更高，MMP-1mRNA的表達(dá)水平更低，P＜0.05。詳見表3。

表3 空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細(xì)胞中各指標(biāo)表達(dá)水平的比較（%，±s ）

表3 空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細(xì)胞中各指標(biāo)表達(dá)水平的比較（%，±s ）

組別 Col ⅠmRNACol ⅢmRNAMMP-1mRNA TIMP-1mRNA空白組（n=10）1.239±0.023 0.210±0.062 1.505±0.117 1.139±0.046溶媒組（n=10）1.233±0.025 0.103±0.012 1.629±0.164 1.082±0.033雌激素（n=10）1.324±0.051 0.926±0.104 1.322±0.102 1.271±0.097 F值 3.097 9.005 4.124 3.765 P值 0.005 ＜0.001 ＜0.001 0.004

3 討論

女性的盆底處于不同程度的力學(xué)環(huán)境下，盆底結(jié)締組織中的成纖維細(xì)胞具有感應(yīng)力，可將力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生化信號，能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的成分來適應(yīng)力學(xué)環(huán)境的改變，維持盆底結(jié)締組織功能和結(jié)構(gòu)的平衡[3]。當(dāng)女性的盆底結(jié)構(gòu)發(fā)生力學(xué)改變后，可引起盆底功能障礙。本研究的結(jié)果顯示，在應(yīng)力作用下，女性陰道壁成纖維細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞由多角形或梭形排列變?yōu)殚L梭形排列，且排列方向多垂直于應(yīng)力方向。女性盆底結(jié)締組織的特性受到細(xì)胞外基質(zhì)的影響，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原代謝的變化會導(dǎo)致盆底結(jié)構(gòu)的支持力發(fā)生改變，最終可引起盆底功能障礙。在應(yīng)力刺激的作用下，女性陰道壁成纖維細(xì)胞成分（如膠原蛋白、纖維粘連蛋白等）的合成會發(fā)生改變。Col Ⅰ、Col Ⅲ是陰道壁成纖維細(xì)胞中主要的膠原類型，也是構(gòu)成盆底結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分。Col Ⅰ的硬度大，可起到支持盆底結(jié)締組織的作用；Col Ⅲ的彈性大，可保證盆底結(jié)締組織的彈性，二者共同維持著盆底支持系統(tǒng)的彈性和韌性。Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)水平的變化會影響盆底結(jié)締組織的生物力學(xué)性質(zhì)。MMP-1具有降解Col Ⅰ、Col Ⅲ的作用，而TIMP-1可與MMP-1結(jié)合，調(diào)節(jié)MMP-1對Col Ⅰ、ColⅢ的降解[4]。本研究的結(jié)果顯示，受到應(yīng)力刺激可導(dǎo)致女性陰道壁成纖維細(xì)胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA的表達(dá)水平增加，使Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平降低。這說明，受到應(yīng)力刺激可改善女性陰道壁成纖維細(xì)胞的膠原代謝狀態(tài)，上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)中Col Ⅰ的表達(dá)水平，下調(diào)Col Ⅲ的表達(dá)水平，使盆底結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)增強、基質(zhì)重塑。雌激素屬于類固醇激素，可通過結(jié)合雌激素受體形成復(fù)合物，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)膠原蛋白的更新，促進(jìn)膠原蛋白的成熟，抑制膠原蛋白的降解[5]。本研究的結(jié)果顯示，與空白組成纖維細(xì)胞及溶媒組成纖維細(xì)胞相比，雌激素組成纖維細(xì)胞中Col ⅠmRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)水平更高，MMP-1mRNA的表達(dá)水平更低，P＜0.05。這說明，采用雌激素進(jìn)行干預(yù)能在一定程度上改善女性陰道壁成纖維細(xì)胞受力后的代謝狀態(tài)，促進(jìn)膠原蛋白的合成，抑制膠原蛋白的降解，改變細(xì)胞外基質(zhì)的成分，促進(jìn)細(xì)胞重塑，改變陰道壁成纖維細(xì)胞對應(yīng)力刺激的應(yīng)答，這可能是雌激素改善盆底功能的重要機制之一。本研究也表明，雌激素對受力后陰道壁成纖維細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)效果有限，并不能完全對抗應(yīng)力刺激的作用。

綜上所述，盆底功能障礙患者的陰道壁成纖維細(xì)胞在應(yīng)力刺激下可出現(xiàn)膠原代謝改變，用雌激素進(jìn)行干預(yù)能在一定程度上改善陰道壁成纖維細(xì)胞膠原代謝的狀態(tài)，阻止盆底功能障礙的進(jìn)展。陰道壁成纖維細(xì)胞對應(yīng)力刺激的應(yīng)答及膠原代謝的改變有望成為盆底功能障礙治療中的研究重點，而雌激素對盆底功能障礙的確切作用機制有待于進(jìn)一步研究。