李維杰 宋立勇 劉寶林 宗 果

(1 上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093；2 上海明悅醫(yī)療科技有限公司 上海 200120)

細(xì)胞低溫保存是用于現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)、器官移植和輔助生殖的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，細(xì)胞治療是目前公認(rèn)對(duì)抗癌癥等疑難雜癥的有效手段,受到各方的廣泛關(guān)注。細(xì)胞的冷凍保存一般是將細(xì)胞冷凍至較低的溫度(通常為-196 ℃)，細(xì)胞在低溫下無(wú)生命活動(dòng)，因此能夠長(zhǎng)期保存，但在冷卻過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。為了減輕冷凍損傷，現(xiàn)在普遍采用的細(xì)胞冷凍方案是在細(xì)胞溶液中加入一定濃度的低溫保護(hù)劑,采用慢速冷凍或玻璃化的方法進(jìn)行冷凍。對(duì)于慢速冷凍，降溫速率會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活率和繼續(xù)發(fā)育造成巨大的影響。根據(jù)兩因素假說(shuō)理論，認(rèn)為細(xì)胞低溫?fù)p傷主要是胞內(nèi)冰損傷[1]和溶液損傷[2-3]，冷卻速率過(guò)快，導(dǎo)致胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生，冷卻速率越快，該損傷越大；冷卻速率過(guò)慢，導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于高濃度溶液中造成溶液損傷，冷卻速率越慢，損傷越大。在降溫速率主導(dǎo)的兩種損傷因素共同作用下，細(xì)胞低溫保存必然存在一個(gè)最佳的降溫速率，使得在該速率下既能夠減少胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，又能避免溶液損傷。但在實(shí)際降溫過(guò)程中，細(xì)胞溶液會(huì)出現(xiàn)過(guò)冷現(xiàn)象[4-5]，較大的過(guò)冷度會(huì)使細(xì)胞溶液因釋放潛熱而溫度上升，導(dǎo)致細(xì)胞的降溫速率遠(yuǎn)高于最佳的降溫速率，較高的降溫速率會(huì)引起細(xì)胞不可控的結(jié)晶，細(xì)胞突然結(jié)冰，脫水不充分，胞內(nèi)冰大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。

降低過(guò)冷度是提高低溫保存效果的關(guān)鍵。目前降低過(guò)冷度主要通過(guò)植冰操作完成，植冰是指通過(guò)人為操作使細(xì)胞溶液在較高的零下溫度提前結(jié)冰的過(guò)程，該過(guò)程可以避免較大過(guò)冷度下的胞內(nèi)冰損傷[6]。傳統(tǒng)的植冰方法主要是用預(yù)冷探針(如金屬棒或手術(shù)鉗)來(lái)接觸容器的側(cè)面，從而提供局部過(guò)冷誘發(fā)成核[7-9]，也可以在細(xì)胞溶液中添加冰核細(xì)菌誘發(fā)凍結(jié)[10-12]，還可以通過(guò)電極誘導(dǎo)[13-15],搖晃、振動(dòng)、超聲[16-18]等機(jī)械能，或改變降溫速率[19]、壓力[20]等方式誘導(dǎo)成核。目前關(guān)于超聲波誘導(dǎo)冰晶生成的研究，僅限于食品材料的凍結(jié)，例如，用于冰淇淋制造，珍貴食品、藥物、疫苗的冷凍濃縮和冷凍干燥等[21-23]，但在細(xì)胞低溫保存領(lǐng)域，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

關(guān)于超聲波影響結(jié)晶的作用機(jī)理尚不明確，針對(duì)超聲成核有三種理論模型，第一種理論模型，R.Hickling[24]認(rèn)為在空化氣泡破裂的最后階段會(huì)發(fā)生大于1 000 MPa正壓力波，由于較高的壓力下空化氣泡附近的液體短暫進(jìn)入亞穩(wěn)態(tài)的過(guò)冷狀態(tài)，從而增加水的平衡凍結(jié)溫度并導(dǎo)致冰成核；第二種理論模型，J.D.Hunt等[25]認(rèn)為空化氣泡破裂的負(fù)壓會(huì)增加水的平衡凍結(jié)溫度并導(dǎo)致成核；第三種理論模型，R.Chow等[26]認(rèn)為當(dāng)空化氣泡產(chǎn)生劇烈的循環(huán)運(yùn)動(dòng)，氣體進(jìn)出氣泡以及周圍的流體中形成強(qiáng)渦流時(shí)均會(huì)形成微流，微流可以增強(qiáng)伴隨冷凍過(guò)程的傳熱和傳質(zhì)過(guò)程，溶液達(dá)到一定過(guò)冷度，可能會(huì)觸發(fā)成核。三種理論模型中，空化氣泡在冰的成核中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)選取人肝細(xì)胞為研究對(duì)象，利用自行設(shè)計(jì)的超聲波植冰裝置研究超聲波誘導(dǎo)成核對(duì)肝細(xì)胞低溫保存的影響，同時(shí)探索超聲波成核的相關(guān)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本文超聲波植冰裝置如圖1所示，由4個(gè)部分組成。1)超聲容器：多個(gè)細(xì)胞凍存管和對(duì)照凍存管可盛放于樣本槽管中，樣本槽管安置在超聲內(nèi)盒體中。2)溫度檢測(cè)系統(tǒng)：由第一熱電偶電極、第二熱電偶電極和溫度數(shù)據(jù)采集模塊組成，第一熱電偶電極放在對(duì)照凍存管內(nèi)，用于實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞溶液的溫度，第二熱電偶電極放在超聲內(nèi)盒體的相變液溶液中，用于實(shí)時(shí)檢測(cè)控溫相變液的溫度。3)超聲波誘導(dǎo)成核系統(tǒng)：由超聲波振子和超聲波發(fā)生器組成，其中超聲波振子均勻的粘結(jié)在樣本槽管的底部，超聲波從樣本槽管底部向上傳播至凍存管中，超聲波頻率為40 kHz，超聲波強(qiáng)度由低到高分別為0.032 9、0.104 1、0.208 8、0.331 2、0.392 5、0.431 6、0.460 7、0.502 6 W/cm2。4)冷卻循環(huán)系統(tǒng)：配制體積分?jǐn)?shù)為38.5%的乙二醇控溫相變液，該溶液可降溫至-20 ℃不結(jié)冰，超聲內(nèi)盒體和低溫恒溫槽中加載配制好的控溫相變液，超聲容器內(nèi)冷凍液與低溫恒溫槽內(nèi)冷凍液組成一個(gè)閉合循環(huán)回路，低溫恒溫槽自帶制冷循環(huán)系統(tǒng)，超聲容器內(nèi)的溫度分布均勻。

1超聲波發(fā)生器；2超聲波振子；3超聲內(nèi)盒體；4、5 控溫相變液；6低溫恒溫槽；7第一熱電偶；8第二熱電偶；9溫度數(shù)據(jù)采集模塊；10對(duì)照凍存管；11細(xì)胞凍存管；12流量控制閥。圖1 超聲波冷凍植冰系統(tǒng)Fig.1 The ultrasonic ice seeding system

1.2 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用主要材料和試劑：L-02原代肝細(xì)胞(購(gòu)于上海富衡生物科技有限公司)，胎牛血清(Gemini公司)，培養(yǎng)基RPMI-1640(Gibco公司)，胰蛋白酶(TBD公司)，二甲基亞砜Me2SO(阿拉丁公司)，PBS緩沖液(TBD公司)，乙二醇(麥克林)，T-25培養(yǎng)瓶(NEST耐思)，50 mL離心管(NEST耐思)，15 mL離心管(NEST耐思)，1.5 mL離心管無(wú)菌(Axygen公司)，2 mL凍存管(NEST耐思)，AO/PI雙染試劑盒(BestBio)。

1.3 儀器和設(shè)備

本文所用儀器設(shè)備：光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)，熒光顯微鏡(日本尼康公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博訊公司)，程序降溫盒(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，低溫恒溫槽(寧波天恒儀器廠)，智能多路溫度測(cè)試儀(常州安柏精密儀器有限公司)，差示掃描量熱儀(德國(guó)耐馳公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞。將它們放在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先觀察培養(yǎng)瓶中的數(shù)量，待細(xì)胞長(zhǎng)滿底壁時(shí)，輕輕吸棄培養(yǎng)瓶里的上清液，向長(zhǎng)滿底壁的L-02細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入1 mL PBS緩沖液，輕柔洗滌兩次后吸棄PBS，加入800 μL胰蛋白酶，將培養(yǎng)瓶置入培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化3 min，待光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)已成圓狀，輕輕拍打培養(yǎng)瓶的側(cè)面，細(xì)胞能夠完全脫離壁面，加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化。利用1 mL的移液槍吸取培養(yǎng)液對(duì)培養(yǎng)瓶底壁進(jìn)行輕柔均勻的反復(fù)吹打，確保細(xì)胞脫離底壁已全部進(jìn)入溶液中，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心4 min,然后重懸于培養(yǎng)基中備用。

1.5 保護(hù)劑結(jié)晶溫度測(cè)量

使用差式掃描量熱儀(DSC)測(cè)量體積分?jǐn)?shù)分別為0%、3%、5%的Me2SO保護(hù)劑的結(jié)晶溫度。將DSC程序設(shè)定為：30 ℃等溫1 min，以30 ℃/min速率降溫至-80 ℃，平衡1 min，再以10 ℃/min速率升溫至30 ℃。參比側(cè)放置一個(gè)空白坩堝，每組保護(hù)劑實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用DSC分析軟件PYRIS Manager分析相變溫度。

1.6 肝細(xì)胞的冷凍保存

肝細(xì)胞凍存方法包括兩種，分別采用超聲波植冰凍存和程序降溫慢速凍存，每組設(shè)置3個(gè)平行組。超聲波植冰凍存的方法如下：提前準(zhǔn)備載冷劑，該液體為體積分?jǐn)?shù)38.5%的乙二醇，溫度最低可降至-20 ℃。將含有不同體積分?jǐn)?shù)(3%、5%、10%)的Me2SO細(xì)胞溶液重懸后，各取500 μL分裝到3個(gè)2 mL的凍存管中，每個(gè)凍存管肝細(xì)胞懸液體積為500 μL，另取凍存管作為對(duì)照凍存管，并添加等量不含肝細(xì)胞的保護(hù)劑溶液，將對(duì)照凍存管和3個(gè)細(xì)胞凍存管同時(shí)放置在超聲波植冰裝置的樣本槽中。植冰時(shí)，首先將搭載好的超聲容器與低溫恒溫槽連接，將配制好的體積分?jǐn)?shù)為38.5%的乙二醇載冷劑注入超聲內(nèi)盒體和低溫恒溫槽中，開(kāi)啟低溫恒槽的制冷循環(huán)系統(tǒng)，待第二熱電偶檢測(cè)到超聲容器內(nèi)控溫相變液溫度達(dá)到指定需要的溫度并保持恒溫狀態(tài)，通過(guò)第一熱電偶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)凍存管溫度，當(dāng)凍存管溫度達(dá)到指定植冰溫度時(shí)，啟動(dòng)超聲波發(fā)生器電源，超聲波啟動(dòng)，植冰結(jié)束后關(guān)閉超聲波，細(xì)胞凍存管在控溫相變液中平衡5 min使冰晶生長(zhǎng)完全，平衡結(jié)束之后蓋上降溫盒的蓋子，將降溫盒轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱進(jìn)行低溫保存過(guò)夜，第二天再將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮凍存24 h。程序降溫慢速冷凍組方法是將含有體積分?jǐn)?shù)分別為3%、5%、10% 的Me2SO的細(xì)胞重懸后，等份分裝到3個(gè)2 mL的凍存管中，每支含有500 μL肝細(xì)胞懸液的凍存管直接裝入程序降溫盒置于-80 ℃的冰箱過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮深低溫保存。

1.7 肝細(xì)胞的復(fù)蘇

低溫保存24 h后，將凍存管從液氮中取出，放入37 ℃水浴鍋中搖晃振蕩2～3 min進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。最后，將凍存管中細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，以1 000 r/min離心4 min，去除上清液，再加入PBS緩沖液清洗一遍，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心4 min,加入完全培養(yǎng)基重懸，以進(jìn)一步檢查細(xì)胞存活率。

1.8 肝細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率測(cè)定

細(xì)胞離心后用培養(yǎng)基重懸1 mL，吸取10 μL的細(xì)胞重懸液到血球計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽內(nèi)，加蓋蓋玻片后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法如式(1)所示，計(jì)數(shù)要求按照：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右的原則，細(xì)胞濃度為1×105～1×106個(gè)/mL。由于AOPI染料比臺(tái)盼藍(lán)染料精確度更高，本實(shí)驗(yàn)采取AOPI染料檢測(cè)細(xì)胞的存活率。為評(píng)估冷凍保存后細(xì)胞的存活率，將離心后細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，用15 μL移液槍吸取15 μL細(xì)胞懸液至1.5 mL離心管中，避光加入15 μL AOPI染液。AOPI染液的配制方法：取100 μL試劑C用900 μL的PBS緩沖液稀釋，充分混勻后，加入10 μL的AO染色液和20 μL的PI染色液。當(dāng)避光加入體積比為1∶1的AOPI染色液后，輕輕混勻在4 ℃避光孵育10～20 min，孵育完成后吸取15 μL細(xì)胞染色液在載玻片的中央，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，熒光顯微鏡激發(fā)光源波長(zhǎng)為488 nm,接受光波長(zhǎng)為520 nm。明場(chǎng)里找到細(xì)胞后，再打開(kāi)熒光在暗室里觀察，最后利用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率如式(2)所示。

(1)

式中：β為細(xì)胞濃度，個(gè)/mL；a為4個(gè)大方格總數(shù)；b為稀釋倍數(shù)。

(2)

式中：γ為細(xì)胞存活率；m為活細(xì)胞數(shù)；n為死細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

獲得的熒光圖片采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件處理。每個(gè)樣本重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，以p<0.05作為差異顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 植冰溫度上閾的確立

利用DSC分析軟件Pyris Manager計(jì)算出不同體積分?jǐn)?shù)Me2SO溶液的熔融溫度，結(jié)果如圖2所示，此處每組僅展示不同體積分?jǐn)?shù)Me2SO中的一次熔融溫度曲線，其中體積分?jǐn)?shù)為0%、3%、5%的Me2SO熔融溫度分別為(-3.77±0.2)℃、(-5.84±0.49)℃、(-7.37±0.81)℃。當(dāng)溶液溫度高于熔融溫度，溶液不會(huì)結(jié)冰，只有當(dāng)溶液溫度低于熔融溫度時(shí)，溶液才有結(jié)冰的可能。根據(jù)相變溫度，可以確定超聲波植冰的溫度范圍。體積分?jǐn)?shù)為0%、3%、5%的Me2SO溶液植冰溫度上閾分別為-4、-6、-7 ℃。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)Me2SO肝細(xì)胞溶液復(fù)溫相變?nèi)廴谇€Fig.2 Melting curves of phase transition in different volume concentrations of Me2SO hepatocyte solution

2.2 超聲植冰對(duì)細(xì)胞凍存的影響

對(duì)使用體積分?jǐn)?shù)分別為5%和10%的Me2SO肝細(xì)胞懸液進(jìn)行傳統(tǒng)慢速冷凍和超聲波植冰操作，預(yù)冷溫度為 -9 ℃，超聲波強(qiáng)度為0.331 2 W/cm2，結(jié)果如圖3所示(不同字母代表有顯著性差異。顯著性：p<0.05；誤差：SD，下同)。由圖3(a)可知，兩個(gè)超聲植冰組均取得較好的保存效果，幾乎無(wú)死細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)為10%的Me2SO組作為實(shí)驗(yàn)室最常用的保存方式，效果相對(duì)較好，但也有部分細(xì)胞死亡，而體積分?jǐn)?shù)為5%的Me2SO組保存效果較差，有較多的死細(xì)胞。結(jié)合圖3(b)可知，10%Me2SO+超聲植冰組和5%Me2SO+超聲植冰組與新鮮組細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異，傳統(tǒng)的保護(hù)劑方案，加入10%Me2SO的細(xì)胞溶液凍存后，細(xì)胞存活率也能夠達(dá)到(87.2±5.6)%，但與新鮮組對(duì)照有顯著差異。當(dāng)降低懸液中Me2SO體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，細(xì)胞存活率僅為(62.2±2.9)%，這也驗(yàn)證經(jīng)典的細(xì)胞保存方案為何使用體積分?jǐn)?shù)為10%的Me2SO。但5%Me2SO+超聲植冰組細(xì)胞存活率能達(dá)到(93.4±1.1)%，與傳統(tǒng)保存方案相比，細(xì)胞存活率大幅提高，且與新鮮對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明超聲植冰有效改善了細(xì)胞低溫保存。

圖3 超聲植冰對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic ice seeding on the survival rate of hepatocytes

2.3 超聲波植冰與傳統(tǒng)植冰方式的對(duì)比

圖4所示為傳統(tǒng)植冰與超聲植冰對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響。當(dāng)添加體積分?jǐn)?shù)為10%Me2SO，預(yù)冷溫度為-9 ℃時(shí)，傳統(tǒng)植冰細(xì)胞存活率為(88.81±1.6)%，超聲植冰細(xì)胞存活率為(92.98±1.7)%，存在顯著性差異；當(dāng)添加體積分?jǐn)?shù)5%Me2SO，預(yù)冷溫度為-9 ℃時(shí)，與傳統(tǒng)植冰方式相比，超聲植冰存活率大幅提高，細(xì)胞存活率達(dá)到(93.4±1.1)%，而傳統(tǒng)植冰方式細(xì)胞存活率僅為(76±1.4)%，顯然超聲植冰在不同體積分?jǐn)?shù)Me2SO下要比傳統(tǒng)植冰更具優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)保存方案相比，傳統(tǒng)植冰在-9 ℃植冰能略微提高細(xì)胞存活率，但降低Me2SO的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，傳統(tǒng)植冰在較低預(yù)冷溫度下植冰的效果不顯著，而超聲植冰在較低的植冰溫度下發(fā)揮了更大的改善細(xì)胞存活率的作用。原因可能是超聲波植冰操作過(guò)程中無(wú)需將凍存管從冰盒中取出，植冰成功率較高，而傳統(tǒng)植冰需要將凍存管反復(fù)取出，溫度波動(dòng)大，且成功率低，充分體現(xiàn)了超聲波植冰一致性強(qiáng)、成功率高、保存效果好的特點(diǎn)。

圖4 傳統(tǒng)植冰與超聲波植冰對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響Fig.4 The effect of traditional ice seeding and ultrasonic ice seeding on the survival rate of hepatocytes

2.4 不同超聲波強(qiáng)度對(duì)肝細(xì)胞凍存的影響

圖5所示為不同超聲波強(qiáng)度對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響。當(dāng)使用體積分?jǐn)?shù)為5%的Me2SO，植冰溫度為-9 ℃時(shí)，超聲波強(qiáng)度分別為0.032 9、0.104 1、0.331 2、0.431 6、0.502 6 W/cm2對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保存，檢測(cè)細(xì)胞的冷凍存活率。當(dāng)超聲波強(qiáng)度小于0.431 6 W/cm2時(shí)，細(xì)胞均得到較好的保存，存活率均在90%以上，滿足樣本庫(kù)等細(xì)胞庫(kù)的需求，組別間無(wú)著性差異，當(dāng)超聲波強(qiáng)度大于0.431 6 W/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率顯著下降。這是由于超聲波植冰利用了空化效應(yīng)，空化氣泡中的氣壓會(huì)增至氣泡無(wú)法承受的程度而發(fā)生破裂[27]，氣泡生長(zhǎng)、收縮、破裂的過(guò)程可以增強(qiáng)伴隨細(xì)胞冷凍過(guò)程中的傳熱和傳質(zhì)過(guò)程[28-29]，降低界面能[30-33]，觸發(fā)成核，大功率的超聲波對(duì)植物細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞[34]，在合適的超聲強(qiáng)度范圍，對(duì)細(xì)胞凍存均有積極影響。

圖5 不同超聲波強(qiáng)度對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響Fig.5 The effect of different ultrasonic intensities on the survival rate of hepatocytes

2.5 植冰溫度對(duì)細(xì)胞存活率的影響

當(dāng)使用體積分?jǐn)?shù)為5% Me2SO，超聲波強(qiáng)度為0.104 1 W/cm2時(shí)，不同植冰溫度(-7、-8、-9 ℃)時(shí)的細(xì)胞存活率如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)植冰溫度為-7 ℃和-8 ℃時(shí)，細(xì)胞得到較好保存，幾乎全部存活，存活率分別為(97±2.6)%、(95.9±0.2)%。當(dāng)植冰溫度為-9 ℃時(shí)，細(xì)胞存活率略有下降，為(90.8±1.9)%，可知不同溫度對(duì)保存效果存在顯著性差異。這是由于植冰溫度越低，細(xì)胞的過(guò)冷度越高，由于過(guò)冷度是造成細(xì)胞死亡的重要因素，應(yīng)盡量提高植冰溫度，減少過(guò)冷度，但植冰溫度不能無(wú)限制提升，必須低于溶液結(jié)晶溫度。

圖6 不同預(yù)冷溫度下超聲波植冰對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響Fig.6 The effect of ultrasonic ice seeding on hepatocytes survival rate under different pre-cooling temperatures

2.6 最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)Me2SO的確立

使用超聲波強(qiáng)度為0.104 1 W/cm2，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)Me2SO(0 %、3 %、5 %)的細(xì)胞懸液進(jìn)行低溫保存，根據(jù)2.5的結(jié)論，在保證植冰成功的前提下，植冰溫度應(yīng)盡量高，即采用對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的上閾溫度(-4、-6、-7 ℃)進(jìn)行植冰。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)Me2SO體積分?jǐn)?shù)為0%時(shí)，細(xì)胞依然有存活，存活率高達(dá)(11.7±2.0)%，而體積分?jǐn)?shù)為3% Me2SO細(xì)胞存活率為(91.32±1.3)%，低于5% Me2SO細(xì)胞存活率為(97±2.6)%時(shí)的保存效果，各組別之間均有顯著性差異。可知，超聲波植冰可以降低細(xì)胞溶液過(guò)程中的過(guò)冷度，改變較大過(guò)冷度下因釋放潛熱而與周圍環(huán)境溫度形成較大溫差，細(xì)胞內(nèi)外形成應(yīng)力，最后形成較快的降溫速率，防止胞內(nèi)冰的形成。Me2SO作為一種小分子的滲透性保護(hù)劑，可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，它們以比水慢的速度進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞因滲透而失水，使胞內(nèi)冰減少，減少胞內(nèi)冰的損傷，有一定的毒性，但植冰操作仍然無(wú)法消除Me2SO的使用。

圖7 熔融溫度下超聲植冰對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響Fig.7 The effect of ultrasonic ice seeding on hepatocytes survival rate at melting temperature

3 結(jié)論

為了提高傳統(tǒng)慢速冷凍方案過(guò)程中細(xì)胞低溫保存后的存活率，降低滲透性保護(hù)劑Me2SO的添加量，本文設(shè)計(jì)的超聲波植冰系統(tǒng)誘導(dǎo)冰晶成核，與傳統(tǒng)的保護(hù)劑方案進(jìn)行對(duì)比，研究了在慢速冷凍過(guò)程中超聲植冰，不同超聲波強(qiáng)度、不同植冰溫度、不同保護(hù)劑濃度對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響，得到如下結(jié)論：

1)當(dāng)超聲波頻率為40 kHz，超聲波強(qiáng)度為0.104 1 W/cm2，預(yù)冷溫度為-9 ℃時(shí)，10%Me2SO+超聲植冰組和5%Me2SO+超聲植冰組低溫凍存后復(fù)蘇肝細(xì)胞存活率分別為(92.98±1.7)%、(93.4±1.1)%，與新鮮組(98.4±1.1)%相比，無(wú)顯著性差異(p<0.05)，比對(duì)應(yīng)保護(hù)劑非植冰操作方案有顯著提高；與10%Me2SO+傳統(tǒng)植冰組和5%Me2SO+傳統(tǒng)植冰組低溫凍存后復(fù)蘇肝細(xì)胞存活率分別為(88.81±1.6)%、(76±1.4)%相比，有顯著性差異(p<0.05)，比傳統(tǒng)植冰組存活率高。

2)當(dāng)超聲波頻率為40 kHz，超聲波強(qiáng)度為0.032 9～0.431 6 W/cm2，預(yù)冷溫度為-9 ℃時(shí)，細(xì)胞存活率均在90%以上，組間無(wú)顯著性差異(p<0.05)，當(dāng)超聲波強(qiáng)度大于0.431 6 W/cm2時(shí)，肝細(xì)胞存活率顯著下降。

3)使用體積分?jǐn)?shù)為5%的Me2SO在-7 ℃超聲植冰，超聲波強(qiáng)度為0.104 1 W/cm2，肝細(xì)胞存活率最高，存活率達(dá)到(97±2.6)%，與新鮮組無(wú)顯著性差異。