趙 凱，陳曉雪，陳雅婧，賈宇臣*

(1.呼和浩特市第一醫(yī)院，呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究中心，呼和浩特 010059)

目前，腦血管病已成為世界范圍內(nèi)主要疾病之一，其具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)[1]，成為中國(guó)第一位致死和致殘的原因，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。全球范圍內(nèi)每年新發(fā)腦卒中病例高達(dá)1 030萬[3]。中國(guó)面臨著世界上最大的卒中挑戰(zhàn)，卒中死亡排名第三[4-5]。腦血管病分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發(fā)病率更高，約占85%，缺血性腦卒中是由腦部血管內(nèi)狹窄或形成血栓, 栓子脫離堵塞血管，引起腦內(nèi)局灶性缺血[6]。臨床上缺血性腦卒中的首要治療方式主要是盡快靜脈溶栓，然而只有少部分患者能在卒中發(fā)生后6 h時(shí)間窗內(nèi)入院接受靜脈溶栓治療[7]，并且在治療過程中往往會(huì)導(dǎo)致缺血再灌注損傷[8]。因此，卒中的治療與預(yù)防成為神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。如何簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定地建立卒中動(dòng)物模型一直是一個(gè)棘手問題。大腦中動(dòng)脈線栓法制備腦缺血模型是經(jīng)典的栓塞模型，可以很好地阻斷大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端缺血，與臨床血管閉塞部位類似度高[9]。但由于不同的操作手術(shù)程序，不同的處理對(duì)模型的成功和穩(wěn)定性影響差異顯著?，F(xiàn)參照Longa線栓法[10]，在線栓的插入方式、血管的分離及處理等方面進(jìn)行探討，旨在建立一種操作簡(jiǎn)單且穩(wěn)定性高、成功率高、術(shù)后生存率高的腦缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion，CI/R)損傷小鼠模型的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康清潔級(jí) C57BL/6小鼠70只，雄性，周齡5～6周，體重25～30 g，購(gòu)于內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(蒙)2016-0001]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上，保持室溫25 ℃，相對(duì)濕度55%。采用隨機(jī)分組方式分為：假手術(shù)組(n=10)、頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)進(jìn)線組(n=30)及頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)進(jìn)線組(n=30)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC(2,3,5-triphenyhetrazolium chloride，TTC，sigma Aldrich，T8877)，4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司，Cat#P1110)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

體式解剖顯微鏡(江西鳳凰光學(xué)科技有限公司，XTL-165)，電凝筆(德國(guó)臺(tái)電，V50)，手術(shù)顯微器械(張家港青松公司，77002、77007)，硅膠線栓(廣州佳靈生物科技有限公司，2000-20)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 缺血再灌注小鼠模型的制備

(1)ECA進(jìn)線組小鼠模型制作過程。術(shù)前禁食24 h，自由飲水。4%水合氯醛按10 g體重0.1 mL劑量腹腔注射麻醉小鼠，5～10 min小鼠翻正反射消失后，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)板上，75%醫(yī)用酒精消毒處理手術(shù)區(qū)，沿頸部正中偏右側(cè)約2 mm處剪開表皮，鈍性分離右側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)，枕動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈(internalcarotid artery，ICA)；在CCA近心端處和ICA遠(yuǎn)心端分別備手術(shù)縫合線一根，前者打活結(jié)，用于牽拉或防滲血，后者用于栓塞后固定線栓；用微血管動(dòng)脈夾夾閉CCA、ICA，接著凝斷枕動(dòng)脈，在ECA靠近頸動(dòng)脈分叉(carotid bifuracation，CB)中間端用顯微剪剪一小口，將頭部直徑0.20 mm的線栓經(jīng)該剪口插入，向CCA方向插入。確認(rèn)線栓進(jìn)入CCA后，使用電凝筆電灼ECA的遠(yuǎn)心端后，牽拉ECA游離端及線栓一同反折，使之與ICA走向一致時(shí)，順勢(shì)緩慢將線栓推入ICA，當(dāng)微感阻力時(shí)即停止送線，自CB處算起，線栓進(jìn)入長(zhǎng)度在9～10 mm，用預(yù)留在ICA遠(yuǎn)心端的備用手術(shù)縫合線固定住線栓；在線栓推進(jìn)過程中，若在大約5 mm處線栓感到強(qiáng)烈阻力，即可能是誤入了ICA的顱外唯一分支翼腭動(dòng)脈(pterygo palatineartery, PPA)，此時(shí)將CCA提緊后，反復(fù)抽出、插入線栓，嘗試幾次后即可使線栓繼續(xù)順利深入；插入90 min后再灌注時(shí)再次麻醉小鼠，打開切口將線栓拔出，電凝ECA游離端，打開CCA近心端處活結(jié)，觀察頸總動(dòng)脈恢復(fù)搏動(dòng)，實(shí)現(xiàn)再通后縫合肌肉和皮膚[10]。術(shù)后，將小鼠置于37 ℃恒溫電熱毯上保溫。

(2)CCA進(jìn)線組小鼠模型制作過程。CCA進(jìn)線組血管分離與上述方法相同。分離出各血管后，在CCA遠(yuǎn)心端和ICA遠(yuǎn)心端備一根縫合線，線一用于牽拉阻斷血流，線二用于栓塞后固定線栓，微血管動(dòng)脈夾夾閉CCA、ICA，在CCA靠近分叉處2～3 mm處剪一小口，線栓經(jīng)該剪口順CCA插入ICA，當(dāng)進(jìn)栓深度9～10 mm微感阻力即停止送線，用預(yù)留手術(shù)縫合線固定住線栓，結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端，90 min后再灌注時(shí)再次麻醉小鼠，打開切口，抽出線栓，永久結(jié)扎CCA與ICA，縫合肌肉和皮膚。術(shù)后，將小鼠置于37 ℃恒溫電熱毯上保溫。

(3)假手術(shù)組制作過程。假手術(shù)組將CCA、ECA、ICA分離后依次縫合肌肉和皮膚即可，不插入線栓。

1.2.2 神經(jīng)缺損評(píng)分即成功率、存活率計(jì)算

術(shù)后24 h，參照Zea Longa方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分，無神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)；1分，表現(xiàn)為提尾懸空左前肢不能伸展，為輕度神經(jīng)損傷；2分，表現(xiàn)為行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，為中度神經(jīng)損傷；3分，行走困難，且向左側(cè)傾倒，為重度神經(jīng)損傷；4分，無法自主行走或昏迷。1～3分為模型成功。剔除造模死亡及沒出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的小鼠[11-12]。計(jì)算公式如下。

V=A1/A2×100%

(1)

S=B1/B2×100%

(2)

式中：V為模型成功率；A1為成功動(dòng)物數(shù)量；A2為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)；S為存活率；B1為存活動(dòng)物數(shù)量；B2為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)。

1.2.3 各組小鼠缺血再灌注后體重變化率情況

在術(shù)前、術(shù)后24 h測(cè)量各組小鼠體重，小鼠體重變化率計(jì)算公式為

W=(W1-W2)/W1×100%

(3)

式(3)中：W為小鼠體重變化率；W1為術(shù)前體重；W2為術(shù)后體重。

1.2.4 腦梗死體積的檢測(cè)

術(shù)后24 h后予以腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，立即斷頭取腦，去除嗅球、小腦和腦干，-20 ℃冷凍20 min后，從前往后行冠狀連續(xù)切片，厚度約為2 mm，將腦片浸泡于0.5% TTC染色液中，37 ℃避光孵育20 min。拍照，染色后正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈白色。采用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)量計(jì)算腦梗死體積，相對(duì)腦梗死體積計(jì)算公式為

I=[(S′1+S′2+…+S′n)-(S1+S2+…+Sn)]/(S′1+S′2+…+S′n)×100%

(4)

式(4)中：S′1,S′2,…,S′n為各層正常側(cè)腦組織面積；S1,S2,…,Sn為各層梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織面積。

1.2.5 腦組織病理學(xué)觀察

小鼠經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)板上，75%醫(yī)用酒精消毒處理胸部，眼科剪沿胸部正中線左側(cè)依次剪開表皮、肌肉和肋骨，暴露出心臟，剪去右心耳，用5 mL注射器吸取生理鹽水在心尖處注射，反復(fù)2～3次，直至右心耳處流出的液體不含血色后，吸取4%多聚甲醛經(jīng)心尖處注入，內(nèi)灌注固定，直至四肢變白，尾巴根部翹起。內(nèi)灌注完成后，立即取出全腦置于4%多聚甲醛溶液24 h后，置于30%蔗糖溶液脫水過夜，石蠟包埋，行冠狀連續(xù)切片，厚度為4 μm，經(jīng)蘇木素/伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)上的病理改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分及存活率、成功率比較

神經(jīng)功能缺損評(píng)分可以直觀判斷小鼠腦損傷程度及模型成功與否。缺血再灌注24 h，采用Zea Longa方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。如表1所示，ECA進(jìn)線組存活率為90%，CCA進(jìn)線組存活率為66.7%，兩組有顯著性差異(P=0.028)。兩組造模成功率為：ECA進(jìn)線組83.3%，CCA進(jìn)線組56.7%，差異有顯著性(P=0.024)。ECA進(jìn)線組在2～3分比率占70.0%，CCA進(jìn)線組占43.3%,差異有顯著性(P=0.037)。CCA進(jìn)線組共30只，存活20只，死亡10只，其中3只為術(shù)中死亡，3只拔出線栓后2 h內(nèi)死亡，4只次日死亡；ECA進(jìn)線組共30只，存活27只，死亡3只，其中術(shù)中死亡1只，次日死亡2只。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)CCA進(jìn)線組有5只小鼠顱底積血塊，可能為蛛網(wǎng)膜下腔出血；ECA組次日死亡的1只小鼠也有此情況。術(shù)中死亡推測(cè)為麻藥過量或神經(jīng)損傷導(dǎo)致。

表1 小鼠模型神經(jīng)功能評(píng)分及存活率

2.2 各組小鼠體重變化比較

術(shù)后24 h測(cè)量各組小鼠體重變化如圖1所示，CCA進(jìn)線組變化率為16.9%±0.9%，ECA進(jìn)線組變化率為19.0%±1.2%，各組間均有差異。從上述結(jié)果可以看出，24 h體重變化率ECA進(jìn)線組大于CCA進(jìn)線組(P<0.05)。

圖1 各組小鼠模型術(shù)前后體重變化率

2.3 各組小鼠腦梗死體積及穩(wěn)定性的比較

腦梗死體積穩(wěn)定性是判斷模型穩(wěn)定性的方法之一，皮層和網(wǎng)狀體同時(shí)出現(xiàn)梗死灶為成功標(biāo)志。術(shù)后24 h后，TTC染色結(jié)果如圖2所示，梗死體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示。CCA進(jìn)線組梗死體積百分比為37.20%±3.89%，ECA進(jìn)線組梗死體積為33.20%±1.30%，兩組差異不顯著(P=0.057，P>0.05)。

圖2 各組小鼠腦組織TTC染色結(jié)果

圖3 各組小鼠腦梗死體積百分比

2.4 各組腦片蘇木素/伊紅染色病理學(xué)檢測(cè)比較

腦片經(jīng)蘇木素/伊紅染色如圖4所示，在光學(xué)顯微鏡下可見，正常小鼠大腦皮層細(xì)胞大小一致，胞質(zhì)均勻，胞膜清晰且完整。ECA組與CCA組模型小鼠梗死部位大腦皮層，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，甚至完全消失，細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變，細(xì)胞間連接呈網(wǎng)狀改變。

圖4 小鼠大腦皮層HE染色結(jié)果

3 討論與分析

腦血管病已成為中國(guó)各類疾病致死的第一病因，尤以缺血性腦卒中占絕大多數(shù)[13]。因此，如何建立一個(gè)穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)易的動(dòng)物模型對(duì)腦血管病分子機(jī)制的研究備受關(guān)注。但由于小鼠腦血管側(cè)枝循環(huán)比較多，大大影響了模型的成功率及穩(wěn)定性，故諸多學(xué)者致力于改進(jìn)方法的研究[14-15]。

利用線栓法制作大腦中動(dòng)脈栓塞模型是研究腦缺血疾病重要依托，隨著生命科學(xué)的發(fā)展，小鼠已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)[16]。建立穩(wěn)定的小鼠缺血模型，對(duì)研究腦血管病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究至關(guān)重要。Longa線栓法有點(diǎn)頗多，術(shù)中對(duì)動(dòng)物的血壓、體溫等影響較小，且穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，被廣泛應(yīng)用[17-18]。

研究發(fā)現(xiàn)，ECA進(jìn)線組與CCA進(jìn)線組相比較，前者能夠提高M(jìn)CAO/R模型的生存率和成功率且腦梗死體積同樣穩(wěn)定，神經(jīng)功能評(píng)分及TTC染色結(jié)果支持此研究結(jié)果。線栓法制作缺血模型，主要有兩種進(jìn)栓方式，一種是直接從頸總動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，另一種是從頸外動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱。對(duì)這兩種進(jìn)栓方式進(jìn)行了比較，CCA進(jìn)線組模型采用前一種線栓插入方式，此方式操作方便，省去了剪斷和電凝ECA殘端這一過程，但再灌注時(shí)拔出線栓后需將頸總動(dòng)脈結(jié)扎，通過前后交通動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)再灌注，導(dǎo)致再灌注血流是非正常生理性的；ECA進(jìn)線組線栓插入方式采用后者，除了分離頸內(nèi)動(dòng)脈還需進(jìn)一步分離頸外動(dòng)脈，但去除線栓實(shí)現(xiàn)再灌注后可以電凝頸外動(dòng)脈殘端，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)四條供應(yīng)腦組織血流的動(dòng)脈完全再通，保證了頸總動(dòng)脈的完整性，以減輕對(duì)小鼠造成的創(chuàng)傷，更加接近生理性再通，提高了模型小鼠的成功率和術(shù)后存活率。小鼠術(shù)后24 h體重變化率提示，ECA進(jìn)線組較CCA進(jìn)線組及假手術(shù)組相比體重變化更高，這可能是ECA進(jìn)線組在拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注時(shí)因未結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈導(dǎo)致出血造成的差異，但體重的變化并未影響小鼠的存活率。傳統(tǒng)方法選擇結(jié)扎PPA，研究也在前期嘗試結(jié)扎了PPA，但因PPA位置較深，操作費(fèi)力耗時(shí)，增加對(duì)小鼠的額外損傷，也存在血栓風(fēng)險(xiǎn)，很多實(shí)驗(yàn)也已不再結(jié)扎PPA[14]，故正式實(shí)驗(yàn)時(shí)未采用。

線栓的制備是模型成功的關(guān)鍵，Longe法[5]選擇將線栓頭部用火焰燒成圓形，起到使線栓頭部光滑不宜戳破血管和增大直徑使大腦中動(dòng)脈完全堵塞的作用。但經(jīng)過前期嘗試發(fā)現(xiàn)此種線栓處理方式不能保證每根線栓頭部直徑一致，增加了不穩(wěn)定因素。而且由于魚線頭部沒有彈性，很難穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)完全阻塞血流，直徑過大不易進(jìn)入顱內(nèi)深部血管增加血管破裂風(fēng)險(xiǎn)，直徑過小起不到完全阻斷血流的效果。還有的研究使用石蠟包被魚線，因石蠟包被易操作、耗時(shí)短、性質(zhì)穩(wěn)定不易與血液成分反應(yīng)，而且石蠟表面光滑，不易損傷血管壁。但經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在魚線誤入PPA反復(fù)抽拉魚線時(shí)，魚線頭部包被的石蠟易脫落，反而增加栓塞風(fēng)險(xiǎn)；硅膠線栓頭部包裹硅膠，直徑使線栓直徑增大有彈性且光滑，當(dāng)線栓向深部走行至較細(xì)血管時(shí)即不會(huì)撐破血管又可有效阻斷血流，同一批次的硅膠線栓可以保證直徑一致。故研究采用硅膠線栓，提高了模型成功率。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別、體重對(duì)模型的成功也有影響，有研究發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)缺血大腦具有保護(hù)作用雄性動(dòng)物大腦對(duì)缺血缺氧敏感性高于雌性動(dòng)物[18]，故實(shí)驗(yàn)采用雄性小鼠；前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體重大于35 g的小鼠造模生存率高，但TTC染色結(jié)果梗死灶卻不明顯，可能是體重大的小鼠血管也相應(yīng)變粗，導(dǎo)致線栓不能完全阻塞大腦中動(dòng)脈的原因。體重小于25 g的小鼠因血管太細(xì)線栓插入困難，導(dǎo)致模型失敗。因組內(nèi)小鼠體重差異越小越有利于減少實(shí)驗(yàn)誤差，故實(shí)驗(yàn)采用25～30 g的小鼠，提高了模型成功率。

對(duì)水合氯醛的濃度也進(jìn)行了摸索，水合氯醛是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的麻醉藥之一，常選用的劑量為10%，0.3～0.4 mL/100 g[14-15,19]，有研究建議C57BL/6雄性小鼠的手術(shù)造模實(shí)驗(yàn)水合氯醛按5%，0.1 mL/10 g給藥[19]，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)采用4%水合氯醛比5%和10%水合氯醛安全且同樣有效麻醉，能減少小鼠術(shù)中死亡例數(shù)，提高了小鼠的存活率。

實(shí)驗(yàn)的不足是未進(jìn)行長(zhǎng)期的術(shù)后觀察，如因CCA結(jié)扎與否是否影響了術(shù)后進(jìn)食，不能得出兩組模型小鼠術(shù)后長(zhǎng)期生存率是否依舊存在差異。但研究結(jié)果提示經(jīng)ECA進(jìn)線方式與經(jīng)CCA進(jìn)線方式相比，在腦梗死體積同樣穩(wěn)定的情況下，經(jīng)ECA進(jìn)線的方法提高了術(shù)后24 h模型小鼠的成功率和生存率，有利于相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展。