馬志敏，許建建，段玉，王春慶，蘇越，張琦，賓羽，周常勇，宋震

柑橘黃化脈明病毒RT-RPA檢測方法的建立

馬志敏，許建建，段玉，王春慶，蘇越，張琦，賓羽，周常勇，宋震

西南大學柑桔研究所/國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712

【】利用逆轉錄重組酶聚合酶擴增技術（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA），結合側向流層析（lateral flow dipstick，LFD）試紙條，建立一種快速簡便、特異、靈敏、裸眼可視的柑橘黃化脈明病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）檢測新方法。根據CYVCV外殼蛋白基因的保守序列設計5對引物，通過樣品檢測篩選出擴增效果好、特異性強的引物對。將選出的引物進行標記物修飾，并設計對應的特異性探針，分別設置6個反應時間梯度（5、10、20、30、40、50 min）和8個反應溫度梯度（37、38、39、40、41、42、43、44℃），對RT-RPA反應條件進行優(yōu)化，建立CYVCV的RT-RPA檢測體系。分別以僅感染了CYVCV、柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎葉病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）、柑橘裂皮病類病毒（citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘鱗皮病毒（citrus psorosis virus，CPV）、溫州蜜柑萎縮病毒（satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘黃龍病菌（Liberibacter asiaticus，Las）和柑橘潰瘍病菌（subsp.，）柑橘材料的總核酸為模板，采用所篩選的最佳引物、探針和反應條件進行檢測，評價所建立RT-RPA檢測體系的特異性。將感染了CYVCV的柑橘總RNA樣品進行10倍梯度稀釋，以原液和10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液作為模板，平行進行RT-PCR及RT-RPA的檢測，評價所建立檢測方法的靈敏度。隨機采集來自田間9個不同品種柑橘的葉片，同時進行RT-RPA和RT-PCR檢測，檢驗所建立RT-RPA檢測方法的適用性。建立了CYVCV的RT-RPA檢測體系：最佳引物為CY1-F/R，對應探針為CY1-Probe（47 bp），最佳反應條件為39℃，30 min，特異擴增目的片段為177 bp，檢測結果可通過側向流層析試紙條直接判讀。特異性檢測結果顯示，利用該檢測體系僅對感染了CYVCV的樣品檢測結果為陽性，其余均為陰性；靈敏度檢測結果顯示，RT-RPA與RT-PCR方法均最低可檢測到10-4稀釋液，兩種方法檢測靈敏度相當。隨機采集的45株田間柑橘樣品中，RT-PCR與RT-RPA均檢測出37個陽性樣品，檢出率均為82.2%，表明該方法檢測效果穩(wěn)定可靠。建立了CYVCV的RT-RPA檢測方法，該檢測方法操作簡單、反應快速，結果裸眼可視，適用于基層條件不足的實驗室或者植檢站現(xiàn)場快速檢測。

柑橘；柑橘黃化脈明病毒；RT-RPA；側向流層析試紙條；快速檢測

0 引言

【研究意義】柑橘黃脈病是由柑橘黃化脈明病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）引起的一種新發(fā)蟲傳病害[1]。CYVCV能夠侵染絕大多數柑橘種類，檸檬和酸橙受感染后，葉片黃化、扭曲、明脈，葉脈背面呈水漬狀，造成大量減產[2-3]，部分雜柑和溫州蜜柑受侵染后表現(xiàn)為葉片卷曲等癥狀，甜橙在實驗條件下也可表現(xiàn)明脈等癥狀。柑橘黃脈病于1988年首次在巴基斯坦發(fā)現(xiàn)[4-5]，2003年Alshami等[6]通過電子顯微鏡觀察到彎曲的絲狀病毒顆粒，并將其病原命名為柑橘黃化脈明病毒。2009年，首次于我國云南省發(fā)現(xiàn)該病[7]，隨后Zhou等[8]對中國11個主要柑橘種植省份進行檢測調查，發(fā)現(xiàn)該病害在其中9個省份已廣泛分布。由于CYVCV可通過帶毒接穗遠距離傳播，并可通過蟲傳和污染農具等高效傳播，近幾年來該病害流行呈加速態(tài)勢，嚴重威脅柑橘產業(yè)，特別是檸檬產業(yè)發(fā)展。早期檢測和應用脫毒苗木是有效防止柑橘黃脈病危害的重要方法，因此建立簡便快速、有效的CYVCV檢測方法，可為柑橘黃脈病的防控提供重要的技術支持?！厩叭搜芯窟M展】CYVCV屬于線性病毒科（）印度柑橘病毒屬（）的正義單鏈RNA病毒。CYVCV基因組由7 529個核苷酸組成，包含6個開放閱讀框（open reading frame，ORF）[9-10]。CYVCV可通過嫁接、繡線菊蚜（）和柑橘粉虱（）等在柑橘之間傳播，可通過機械摩擦接種到莧色藜（）、昆諾藜（）、菜豆（）和豇豆（）等草本植株[1,5,11-13]。以往CYVCV的檢測技術如指示植物檢測法[5]、電子顯微鏡檢測法[6]、血清學檢測法[6, 9,14-15]和核酸分子檢測技術[9,16-19]等大多具有操作復雜、檢測時間長、需要復雜的實驗儀器、對實驗操作者要求較高等問題。逆轉錄重組酶聚合酶擴增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）是一種新型等溫核酸擴增技術，該技術的原理主要模仿T4噬菌體的核酸復制機制，依賴重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換聚合酶，在恒溫條件下實現(xiàn)與模板的特異性識別和擴增，其目標產物可通過凝膠電泳或添加特異性探針通過試紙條呈現(xiàn)[20-22]。由于具有快速、靈敏、操作簡便等特點，該技術現(xiàn)已廣泛應用于多種動植物病害的檢測[23-28]。在柑橘上，該技術已應用于柑橘黃龍病菌（Liberibacter asiaticus，Las）的快速檢測[29]。【本研究切入點】目前，國內外尚未有利用RT-RPA對CYVCV進行檢測的報道?！緮M解決的關鍵問題】利用RT-RPA技術結合側向流層析試紙條，通過引物篩選和反應條件優(yōu)化，建立一種簡易、快速、裸眼可視的CYVCV檢測新方法，為基層條件不足的實驗室或植檢站現(xiàn)場快速檢測CYVCV提供新的選擇。

1 材料與方法

試驗于2020年在西南大學柑桔研究所脫毒中心完成。

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本試驗所使用的感染了柑橘黃化脈明病毒、柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎葉病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）、柑橘裂皮病類病毒（citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘鱗皮病毒（citrus psorosis virus，CPV）、溫州蜜柑萎縮病毒（satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌（subsp.，）的柑橘材料及健康柑橘材料，均由柑桔研究所脫毒中心提供。田間檢測樣品采于柑桔研究所展示園和母本園。

1.1.2 主要試劑與儀器 Trizol reagent（Ambion）、RT-RPA核酸擴增試劑（基礎型）（眾測）、RT-RPA-nfo核酸擴增試劑（試紙條型）（眾測）、HybriDetect試紙條（安普未來）、Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa）、Nanodrop2000分光光度計（Thermo）、PCR儀（Biometra Tgradient）、水平電泳槽（Sub-cell GT wide Mini，BioRad）、凝膠成像儀（立德賽，成都）。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA制備 取50—100 mg待測樣品的葉片，使用Trizol法提取植柑橘樣品的總RNA，使用瓊脂凝膠電泳檢測RNA完整性，用分光光度計測定其濃度和純度，將純度良好的樣品核酸保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 引物篩選以及探針設計 利用CLC軟件對已報道的CYVCV基因組序列（GenBank登錄號：MG878869、KX156740、KX156738、KP313240、KP313242）進行比對，尋找保守區(qū)段，按照RT-RPA引物設計原則：引物長度30—35 bp，無二級結構和單堿基重復序列，擴增片段大小100—200 bp[20]，通過Primer Premier 5軟件設計5對引物CY1-F/R、CY2-F/R、CY3-F/R、CY4-F/R、CY5-F/R（表1）。

用RT-RPA（基礎型）試劑盒進行引物篩選試驗。以感染CYVCV陽性樣本的核酸為模板，清水為對照，進行RT-RPA反應，根據結果進行篩選。RT-RPA反應體系（總體積50 μL）：在反應管中依次加入A buffer 41.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，核酸2 μL，充分混勻，再加入B buffer 2.5 μL，充分振蕩混勻，瞬時離心10 s，置于42℃金屬浴上反應30 min。RPA 反應結束后，向反應物中加入等體積25﹕24﹕1溶液50 μL，輕輕渦旋，充分混勻，10 000 r/min離心2 min，吸取5 μL上清液進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結果，選出最佳引物對。

表1 本試驗所用引物

針對篩選出的最佳引物進行修飾以及設計對應探針。下游引物的5′端添加抗原標記Biotin進行修飾。探針設計原則：探針序列不與引物識別序列重疊，長度在46—52 nt，內部無二級結構和連續(xù)的重復堿基，探針的5′端用抗原標記物FAM基團修飾，將距5′端30 bp處的堿基替換為堿基類似物四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF），探針3′端用聚合酶延伸阻斷基團C3-spacer進行修飾。

1.2.3 反應產物測序鑒定 將選出引物的RT-RPA擴增產物經瓊脂糖電泳分離后，切取目的條帶，使用膠回收試劑盒純化切膠產物，送往擎科公司測序，將測序結果與參考基因序列進行比對，確定反應擴增產物是否為目的片段。

1.2.4 RT-RPA體系建立及優(yōu)化 利用RT-RPA-nfo（試紙條型）試劑盒，修飾后的優(yōu)選引物以及探針優(yōu)化反應體系。設置6個反應時間梯度（5、10、20、30、40、50 min）和8個反應梯度溫度（37、38、39、40、41、42、43、44℃），根據電泳和試紙條檢測結果，篩選出最佳反應時間和溫度，建立RT-RPA檢測體系。

RT-RPA-nfo（試紙條型）擴增反應體系（總體積50 μL）：在反應管中依次加入A buffer 41.5 μL，修飾后的上下游引物（2 μmol·L-1）各2 μL，探針（2 μmol·L-1）0.2 μL，核酸2 μL，B buffer 2.5 μL。反應結束后，向反應物中加入等體積25﹕24﹕1溶液50 μL，混勻離心后，吸取5 μL上清液進行瓊脂糖凝膠電泳，再吸取5 μL上清液于干凈的離心管中，加入95 μL去離子水稀釋20倍，將HybriDetect試紙條插入離心管中，約1 min后判讀結果，根據電泳結果和試紙條檢測結果，選出最佳反應時間和反應溫度，最終確定最佳反應體系。

HybriDetect試紙條結果判讀方法：當質控線（control line）呈藍色或紅色，且測試線（test line）呈紅色，結果判定為陽性；試紙條質控線呈藍色，檢測區(qū)沒有條帶，結果判定為陰性；質控線和檢測區(qū)均未出現(xiàn)條帶，表示所使用試紙條失效、損壞或操作有誤，檢測結果無效。

1.2.5 特異性檢測 提取僅攜帶CYVCV、CTV、CLBV、CTLV、CEVd、CPV、SDV、Las、的柑橘樣品總RNA，采用優(yōu)化后的方法分別對其進行檢測，以攜帶CYVCV的陽性柑橘樣品為正對照，以健康柑橘樣品為負對照，根據電泳結果和試紙條檢測結果，確定該檢測方法的特異性。

1.2.6 靈敏度檢測 將提取的陽性樣品總RNA按10倍梯度稀釋，以原液和10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液作為模板，平行使用RT-RPA和RT-PCR進行檢測，比較兩種方法的檢測靈敏度。RT-RPA反應體系同1.2.4，RT-PCR檢測使用一步法RT-PCR試劑盒參照陳洪明等[16]的方法及引物，檢測反應體系（總體積10 μL）以及程序：Prime script 1 step enzyme 0.4 μL，2×1 step buffer 5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，D&R-nase free water 3.2 μL，模板1 μL；50℃反轉錄30 min，94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，72℃后延伸5 min，4℃保存。

1.2.7 適用性檢測 以西南大學柑桔研究所內隨機采摘的9個柑橘品種共45株樣品為檢測對象，應用所建立的RT-RPA檢測方法進行CYVCV的檢測，平行進行CYVCV的RT-PCR檢測，攜帶CYVCV的陽性柑橘樣品為正對照，健康柑橘樣品為負對照。比較兩種方法的檢測結果，評價RT-RPA檢測方法的適用性。

2 結果

2.1 RT-RPA檢測體系建立及優(yōu)化

2.1.1 引物篩選 以感染CYVCV陽性樣本的核酸為模板，分別使用設計的5對RT-RPA引物進行擴增。結果顯示，引物CY1-F/R、CY3-F/R、CY5-F/R均能擴增出單一明亮的條帶（圖1-A）。為進一步篩選最佳檢測引物，取感染了CYVCV陽性植株不同部位（嫩葉、嫩皮、老葉、老皮）的樣品抽提總核酸，分別用3對引物進行檢測，結果也均擴增出單一的目的條帶。其中CY1-F/R條帶更明亮更清晰（圖1-B），說明CY1-F/R擴增效果更好。對CY1-R的5′端添加抗原標記Biotin進行修飾，設計對應探針CY1-Probe（47 bp）進行后續(xù)試驗（表1）。

2.1.2 擴增產物鑒定 將利用引物CY1-F/R擴增出的產物測序，測序結果與參考基因序列的比對結果顯示，該產物長度為177 bp，與目標CYVCV基因片段長度一致，與參考序列的相似率為100.00%（圖2），說明RT-RPA擴增產物為目標CYVCV片段。

2.1.3 反應體系優(yōu)化 檢測結果表明，在所設置反應時間梯度（5、10、20、30、40、50 min）下，隨反應時間增加，電泳條帶亮度逐漸增加，在20、30、40和50 min時，條帶亮度無明顯差異（圖3-A），但試紙條檢測時反應時間為20 min時，測試區(qū)條帶不明顯，當反應時間達到30 min后，試紙條測試區(qū)條帶變化無明顯差異（圖3-B），故選擇反應時間為30 min。在所設置反應梯度溫度（37、38、39、40、41、42、43和44℃）下，均能擴增出單一條帶，39℃時電泳條帶最明亮（圖4-A、4-B），試紙條測試區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶，但是紙條無明顯變化，故選擇39℃為最適反應溫度。

M：標準分子量，下同standard molecular weight. The same as below。A：1：陽性樣品positive sample；2：ddH2O。B：1：嫩葉young leaf；2：嫩皮young bark；3：老葉old leaf；4：老皮old bark

圖2 RT-RPA擴增產物的序列比對

2.2 RT-RPA檢測體系評價

2.2.1 特異性檢測 利用所建立的柑橘黃化脈明病毒RT-RPA檢測體系分別對僅感染了CYVCV、CTV、CEVd、CTLV、CLBV、CPV、SDV、和las的樣品進行檢測。電泳和試紙條結果均顯示，只有感染了CYVCV的樣品檢測呈陽性，而感染其他8種柑橘病害的樣品均檢測呈陰性（圖5-A、5-B）。表明所建立的CYVCV RT-RPA檢測體系與其他柑橘病原無交叉反應，特異性強。

2.2.2 靈敏度檢測 將CYVCV檢測為陽性的樣品總核酸進行10倍梯度濃度稀釋，原液及其梯度稀釋液分別進行RT-RPA和RT-PCR反應。電泳檢測結果顯示，當總核酸稀釋至10-4時，兩種方法能檢測出CYVCV（圖6-A、6-B），當總核酸稀釋至10-5時RT-RPA和RT-PCR電泳檢測仍有微弱條帶，但是RT-RPA試紙條檢測結果顯示測試區(qū)無條帶（圖6-C），表明兩種檢測方法的檢測靈敏度基本相當。

圖3 RT-RPA檢測柑橘黃化脈明病毒反應時間篩選

圖4 RT-RPA檢測柑橘黃化脈明病毒反應溫度篩選

1：柑橘黃化脈明病毒CYVCV；2：柑橘衰退病毒CTV；3：柑橘葉斑駁病毒CLBV；4：柑橘碎葉病毒CTLV；5：柑橘裂皮病類病毒CEVd；6：柑橘鱗皮病毒CPV；7：溫州蜜柑萎縮病毒SDV；8：柑橘潰瘍病菌Xcc；9：柑橘黃龍病菌Clas；10：正對照positive control；11：負對照negative control

A：RT-PCR；B、C：RT-RPA；100—10-7：稀釋倍數Degree of dilution

2.2.3 適用性檢測 田間隨機采集9個不同品種共45個柑橘樣品，分別進行RT-PCR和RT-RPA檢測。RT-PCR和所建立的RT-RPA法檢均測出37個陽性樣品（圖7），檢出率為82.2%（表2），兩種檢測方法檢測結果相同，表明該檢測方法效果良好，檢測效果穩(wěn)定可靠。

A：RT-PCR；B、C：RT-RPA；1、2：沃柑orah；3—7：愛媛38 ehime 38 hybrid citrus；8：正對照positive control；9：負對照negative control

表2 不同柑橘品種的RT-RPA 及RT-PCR 檢測

3 討論

CYVCV是近年來危害柑橘尤其是檸檬的重要病毒之一。隨著柑橘產業(yè)的大發(fā)展，地域間種質資源交流、苗木調運頻繁，我國普遍存在其高效傳播蟲媒，使得該病毒的流行呈加速擴散態(tài)勢[1,8]。因此，建立一種快速、準確的CYVCV檢測方法對柑橘黃脈病的防控具有重要意義。

本研究將RT-RPA技術應用于柑橘黃化脈明病毒的檢測，結合側向流層析試紙條，建立了CYVCV的RT-RPA檢測體系。該體系與柑橘衰退病毒、柑橘裂皮類病毒、柑橘碎葉病毒、柑橘黃龍病菌、溫州蜜柑萎縮病毒等常見柑橘病原均無交叉反應，特異性強。檢測靈敏度與RT-PCR靈敏度一致，并且對田間樣品檢測的結果穩(wěn)定可靠，適用性良好。劉科宏等[19]建立的實時環(huán)介導等溫核酸擴增（RT-LAMP）法和陳洪明等[17]建立的實時熒光RT-PCR法檢測CYVCV的靈敏度分別是RT-PCR方法[16]的10倍和100倍，本試驗所建立的RT-RPA檢測方法靈敏度與RT-PCR相當，雖然靈敏度低于RT-LAMP和實時熒光RT-PCR，但不需要實時熒光PCR儀，也不需要設計RT-LAMP復雜的引物，反應溫度更低，操作也更為簡潔，反應時長縮短了約一半。同時通過在反應體系中加入特異性探針，增強了RT-RPA檢測的特異性。本試驗將RT- RPA技術與側向流層析技術相結合，檢測結果可使用試紙條呈現(xiàn)，更加直觀、簡明。同時，RT-RPA所需反應溫度更低，甚至僅靠人體體溫即能完成反應[30]，這也促進了該技術在基層的推廣使用。因而，本試驗建立的RT-RPA檢測方法與上述兩種檢測方法相比具有一定優(yōu)勢。

RT-RPA技術作為一種新型核酸擴增技術，具有特異性強、靈敏度高、操作快速便捷等優(yōu)點，已逐漸應用于眾多動植物病原的檢測。不過，目前該技術方法所用試劑的成本較高，相信隨著技術的不斷成熟，應用范圍的不斷擴大，該技術的檢測成本將不斷降低，應用前景將更為廣闊。柑橘病毒病害種類繁多，將RT-RPA技術應用于更多柑橘病害的檢測，從而為基層人員提供新的快速簡便又可視化的檢測手段，對于相應病害的防控具有積極意義。

4 結論

建立了柑橘黃化脈明病毒的RT-RPA快速檢測方法。該方法靈敏度高、特異性強、反應快速、操作簡單、適用性好，可肉眼直接觀察結果，無需大型精密儀器，可滿足基層檢測需求，具有較大的應用潛力。

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Establishment of RT-RPA for citrus yellow vein clearing virus (CYVCV) detection

MA ZhiMin, XU JianJian, DUAN Yu, WANG ChunQing, SU Yue, ZHANG Qi, BIN Yu, ZHOU ChangYong, SONG Zhen

Citrus Research Institute, Southwest University/National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712

【】The objective of this study is to establish a fast, simple, accurate and visualized with naked eyes new detection method for citrus yellow vein clearing virus(CYVCV) using reverse transcription-recombinase polymerase amplification (RT-RPA) combined with lateral flow dipstick (LFD).【】Five pairs of primers were designed according to the conservative sequence of the coat protein gene of CYVCV. By detecting different samples, the pair of primers with the best amplification efficiency and specificity was selected. The selected primers were modified and its corresponding specific probe was designed. According setting 6 reaction gradient times (5, 10, 20, 30, 40 and 50 min) and 8 reaction gradient temperatures (37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 and 44℃), the RT-RPA system for CYVCV detection was optimized. The specificity of the established RT-RPA was evaluated by detecting the samples infected with CYVCV, citrus leaf blotch virus (CLBV), citrus tristeza virus (CTV), citrus tatter leaf virus (CTLV), citrus exocortis viroid (CEVd), citrus psorosis virus (CPV), satsuma dwarf virus (SDV),Liberibacter asiaticus (Las) andsubsp.(), respectively. The citrus total RNA samples infected with CYVCV was diluted by 10 times. The original RNA solution and 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7dilutions were used as templates for testing the sensitivity of RT-RPA, and the sensitivity was compared with RT-PCR. Leaves of different citrus varieties were randomly collected from the field. RT-RPA and RT-PCR were used at the same time to test the applicability of the established RT-RPA detection method.【】A RT-RPA detection system for CYVCV was established, with primer pairs CY1-F/R and corresponding probe CY1 (47 bp). It could specifically amplify the target fragment of CYVCV with a size of 177 bp. The best reaction conditions were 39℃, 30 min. The result could be judged by the LFD test strip directly. In the specific test, only samples infected with CYVCV were positive, and the rest were negative. In the sensitivity detection, 10-4dilution was the lowest detection sensitivity of RT-RPA and RT-PCR. The sensitivity of the two methods was equivalent. Among the 45 field citrus samples taken randomly, 37 samples were positive by RT-PCR and RT-RPA, and the positive rate was both 82.2%, indicating that the RT-RPA method established in this study was stable and reliable.【】A RT-RPA detection method for CYVCV is established. The method is convenient, rapid, and visualized. It can be applied to on-site rapid detection for the labs with insufficient basic conditions or plant protection and quarantine station.

citrus; citrus yellow vein clearing virus (CYVCV); RT-RPA; lateral flow dipstick test strip; rapid detection

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.009

2020-11-12；

2020-12-28

國家自然科學基金（31972237）、國家重點研發(fā)計劃（2018YFD02021500）、國家現(xiàn)代農業(yè)柑橘產業(yè)技術體系（CARS-26-05B）

馬志敏，E-mail：mazhimin02@163.com。通信作者周常勇，E-mail：zhoucy@cric.cn。通信作者宋震，E-mail：songzhen@cric.cn

（責任編輯 岳梅）