渠可心，韓露，謝建國，潘文婧，張澤鑫，辛大偉，劉春燕，陳慶山，齊照明

基于RIL和CSSL群體定位大豆脂肪酸組分QTL

渠可心，韓露，謝建國，潘文婧，張澤鑫，辛大偉，劉春燕，陳慶山，齊照明

東北農業(yè)大學農學院大豆遺傳改良實驗室，哈爾濱 150030

【】大豆（）原產于中國，高品質的大豆在食品、飼料、紡織品等多種加工業(yè)中廣泛應用，因此，選育高品質大豆已成為育種者和生產者的聚焦問題。通過對大豆脂肪酸各組分進行QTL定位及候選基因的篩選，為大豆品質改良奠定分子基礎。以美國大豆品種Charleston和東農594為親本構建重組自交系（RILs）、以栽培大豆綏農14與野生大豆ZYD00006為親本構建染色體片段代換系（CSSLs）為試驗材料。利用氣相色譜法測定2個群體的脂肪酸含量，根據東北農業(yè)大學農學院大豆遺傳改良實驗室已構建的遺傳圖譜，通過Windows QTL Cartographer 2.5和ICIMapping軟件對2017—2018年RIL群體與CSSL群體中的大豆脂肪酸組分進行QTL定位研究，并對所獲得的QTL置信區(qū)間進行候選基因的挖掘。2017—2018年，RIL群體和CSSL群體分別定位到34和20個與脂肪酸組分相關的QTL，分布在除B2、C1、G、H、J、M和O以外的13個連鎖群上。比較2個群體的QTL定位結果，發(fā)現在2個群體中重復檢測到10對QTL，其中，分布在A1、C2、D1a、F、K和N連鎖群上的QTL與多種脂肪酸含量相關，在A1連鎖群上檢測到亞油酸和油分含量重疊的QTL；在C2連鎖群上檢測到硬脂酸和油分含量重疊的QTL；在D1a連鎖群上檢測到硬脂酸和油分含量重疊的QTL；在F連鎖群上檢測到棕櫚酸、硬脂酸和油分含量重疊的QTL；在K連鎖群上檢測到亞油酸和亞麻酸含量重疊的QTL；在N連鎖群上檢測到棕櫚酸和油分含量重疊的QTL、油酸和亞油酸含量重疊的QTL。對QTL定位獲得的所有置信區(qū)間進行候選基因的挖掘，從基因注釋數據集中共篩選出485個候選基因，其中，271個候選基因具有GO注釋，進一步進行GO富集數據分析，共有15個候選基因與脂肪酸相關。主要通過編碼植物?；??；d體蛋白（ACP）硫酯酶、脂肪酸去飽和酶、磷脂酶D1、脂肪酸-羥化酶、丙酮酸激酶和參與酰基輔酶A生物合成、調節(jié)脂肪酸鏈的延伸，從而影響脂肪酸的合成。共檢測到54個與大豆脂肪酸各組分相關的QTL，在2個群體中重復檢測到10對QTL，對QTL定位獲得的置信區(qū)間進行候選基因的篩選，共有15個候選基因與脂肪酸相關。這些穩(wěn)定的脂肪酸相關的QTL和脂肪酸相關的候選基因可用于大豆脂肪酸改良的分子標記輔助選擇。

大豆；導入系；氣相色譜法；QTL定位；基因挖掘；富集分析

0 引言

【研究意義】大豆（）原產于中國，是一種重要的經濟作物，占世界油籽產量的61%，蛋白質食物消費量的68%[1]。大豆是植物油的主要供給原料，油分含量占籽粒干重的18%—23%，主要包含5種重要脂肪酸組分：棕櫚酸（palmitic acid）、硬脂酸（stearic acid）、油酸（oleic acid）、亞油酸（linoleic acid）和亞麻酸（linolenic acid）。大豆已經成為人們日常生活中膳食消耗不可缺少的食品，與國民糧食安全的可持續(xù)發(fā)展緊密相連[2-4]。目前，中國處于大豆進口最多的國家，而且高品質的大豆在食品、飼料、紡織品等多種加工工業(yè)中的需求量日益劇增，出現了較為明顯的供需矛盾，鑒于這一問題，選育高品質大豆新品種已成為育種者和生產者的聚焦問題[5-6]?！厩叭搜芯窟M展】大豆脂肪酸中，亞油酸含量最高，油酸次之，亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸含量相對較低[7]，其中，油酸已被證明可以降低血液中的膽固醇含量[4]，亞油酸已被證明可以防止動脈硬化的作用[8]，亞麻酸具有降血壓、健腦抗衰老等作用[9]。因此，在衡量大豆油品質的優(yōu)劣中，脂肪酸各組分的比例是一個非常重要的指標。大豆脂肪酸組分含量的檢測方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[10-11]、近紅外反射光譜分析法（near infrared reflectance spectrometry，NIRS）[12-13]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[14-15]，而氣相色譜法是應用最為廣泛的[16]。氣相色譜法是色譜法中的一種，主要是利用混合物各物質之間的沸點、極性及吸附性的差異性來實現分離，目前，現代分離分析主要應用該技術[17]。大豆脂肪酸的5種組分是由多基因控制的數量性狀，容易受不同環(huán)境條件的影響[18]。國內外研究學者鑒定影響大豆籽粒貯藏物含量的QTL位點，主要通過分子標記技術結合區(qū)間作圖（interval mapping，IM）[19]、復合區(qū)間作圖（composite interval mapping，CIM）[20]、多區(qū)間作圖（multiple interval mapping，MIM）[21]和完備區(qū)間作圖（inclusive composite interval mapping，ICIM）[22]等常用的分析方法來進行。QTL定位的實質是分析分子標記與目標性狀之間的連鎖關系[23]，隨著分子生物技術的飛速發(fā)展，國內外研究學者已開發(fā)出適應各種情況的QTL定位方法，大大地解決了分子輔助育種過程中所遇到的難題，為分子輔助育種的高效快速發(fā)展奠定了堅實基礎[24]。目前，國內外的研究學者對大豆脂肪酸含量進行了大量的QTL定位研究[25-26]。Li等[27]共定位到26個與脂肪酸含量相關的穩(wěn)定QTL；XIA等[28]對2個群體在不同環(huán)境下進行大豆脂肪酸各組分的QTL定位分析，共定位到16個相關的QTL；FAN等[29]共定位到52個相關的QTL；盛英華等[30]對2個群體的脂肪酸含量進行QTL定位分析，共定位到57個相關的QTL?！颈狙芯壳腥朦c】目前，雖然與大豆脂肪酸相關的QTL已被大量報道，但是可以在不同環(huán)境或不同遺傳背景中被重復檢測到的QTL較少[31]?！緮M解決的關鍵問題】本研究于2017年和2018年測定190份染色體段代換系（chromosome segment substitution lines，CSSLs）群體及親本和147份重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）群體及親本的脂肪酸各組分含量，并對大豆脂肪酸各組分進行QTL定位，以期獲得能在不同遺傳背景下被重復檢測到的脂肪酸QTL。對檢測到QTL的定位區(qū)段進行候選基因的挖掘，并選擇與脂肪酸相關的基因，為后續(xù)與脂肪酸各組分相關基因的精細定位及基因功能的研究奠定基礎，并對大豆品質改良方面具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用東北農業(yè)大學農學院大豆遺傳改良實驗室歷經12年構建，以栽培大豆綏農14與野生大豆ZYD00006為親本，并以綏農14為輪回親本，采用分子輔助選擇段構建的一套全基因組染色體片段代換系（CSSLs）的190份材料。以美國半矮稈大豆品種Charleston（♂，中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供）和高蛋白大豆品系東農594（♀，東北農業(yè)大學大豆研究所提供）親本構建的重組自交系（RILs）群體的147份材料。2017—2018年播種在具有適當土壤含水量（15%—20%）的中國哈爾濱（45.75°N，126.53°E）的向陽農場試驗田，采用完全隨機區(qū)組設計，行長5 m，株距5 cm，壟距60 cm，3次重復，田間管理遵循正常的生產實踐。

1.2 脂肪酸的測定方法

采用Agilent7890B氣相色譜儀測定大豆脂肪酸的5種組分，每份材料隨機選取3粒籽粒，于65℃烘箱中烘干（12—14 h），研磨成粉末，稱取5 mg左右樣品，置于儲存管中。在儲存管中分別加入1 mL 2.5%的濃硫酸甲醇溶液、5 μL BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚50 mg·mL-1，甲醇溶解）還原劑和50 μL的內標十七烷酸（10 mg·mL-1，乙酸乙酯溶解），混勻后85℃水浴1.5 h，冷卻至室溫，加入160 μL 9%的NaCl溶液和700 μL正己烷，渦旋、震蕩，4 000 r/min常溫離心10 min，吸取上清液400—500 μL于新儲存管中，置于通風櫥中吹干、過夜。最后加400 μL乙酸乙酯并迅速用氣相色譜儀進行脂肪酸的測定，每個樣品測定3次，取平均值作為該脂肪酸組分的含量。

Agilent7890B氣相色譜儀所用色譜柱型號為：30 m×320 μm×0.25 μm。載氣：氮氣60 mL·min-1，氫氣60 mL·min-1，空氣450 mL·min-1。進樣量：1 μL，分流進樣方式，分流比為10﹕1；進樣口溫度170℃。反應程序為180℃保持1 min，以25℃·min-1的速率上升至250℃保持7 min。

氣相色譜分析過程中，首先試樣在汽化室內被汽化，然后被惰性氣體（即流動相）帶入色譜柱，柱內含有固定相，由于試樣中各組分之間的氣相和固定相之間的分子作用力不同，使得在色譜柱中各個組分的運行速度不同，從而產生了不同的峰值，最后分析色譜圖中各種組分的峰值，計算出不同組分的相對含量[21]。

1.3 脂肪酸各組分含量計算

氣相色譜儀的峰圖是以標準溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，從而繪制不同濃度梯度的標準曲線[16]。根據5種脂肪酸標準樣品的保留時間和峰面積進行定性定量分析各個脂肪酸組分，以十七烷酸的峰值為內標，計算5種脂肪酸的絕對含量（mg·g-1）和相對含量（%），油分含量為5種脂肪酸的總和。

相對量計算公式：。

1.4 脂肪酸含量表型及QTL分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對2個群體親本和后代單株脂肪酸各組分進行基本統(tǒng)計量分析，包括最小值、最大值、平均值、變異系數、標準差、變異幅度、偏度和峰度。采用SPSS軟件對脂肪酸各組分進行相關性分析。

RIL群體的遺傳圖譜由QI等[32]構建完成，圖譜總長度為2 655.68 cm，包括5 308個特異長度擴增片段標記，覆蓋20個連鎖群（linkage group，LGs），標記間平均距離為0.5 cm。CSSL群體的遺傳圖譜由XIN等[33]構建完成。使用Win-QTLCart2.5軟件通過CIM對RILs群體進行QTL定位，使用1 000次排列檢驗分析表型數據，并設置顯著性=0.05，取LOD=2.5為閾值判斷QTL的存在。采用ICIM Mapping軟件中ICIM對CSSLs群體進行與脂肪酸相關的QTL定位分析，使用1 000次排列檢驗分析表型數據，并設置顯著性=0.05。QTL命名基于前研究者的方法，簡而言之，QTL名稱的構造如下：+性狀名稱+連鎖群或連鎖群數+“-”+QTL數目[34]。

2 結果

2.1 2個群體的脂肪酸含量和油分總量分布情況

運用氣象色譜儀對2017—2018年的RILs和CSSLs群體籽粒中的5種脂肪酸含量和油分總量進行測定，并計算5種脂肪酸和油分含量的頻率分布，以分析大豆籽粒在不同年份、不同群體脂肪酸積累的特點。結果表明，2017—2018年2個群體的脂肪酸各組分都呈現連續(xù)正態(tài)分布（圖1和圖2），表明脂肪酸是以數量方式遺傳的，并適用于脂肪酸各組分含量的QTL定位。油分含量變化范圍為19.66%—24.26%，符合正態(tài)分布（圖3），適用于油分含量的QTL定位，此外，在后代中也觀察到明顯的超親分離現象[27]，表明父母雙方對脂肪酸組成都有貢獻。

X軸代表脂肪酸各組分所占總油分的百分比，Y軸代表每個脂肪酸各組分所占總油分百分比的株系數，黑色實線表示RILs群體的正常曲線。2018年RILs群體的5種脂肪酸含量頻率分布與2017年的結果相同，呈現連續(xù)正態(tài)分布，所以在這里僅展示了2017年的結果。下同The X-axis represents the percentage of each fatty acid component to the total oil content, the Y-axis represents the plant coefficient of the percentage of each fatty acid component in the total oil content, and the black solid line represents the normal curve of the RILs population. The frequency distribution of the five fatty acid content of the RILs population in 2018 is the same as the 2017 results, showing continuous normal distribution, so only the 2017 results are shown here. The same as below

黑色實線表示CSSLs群體的正常曲線

2.2 RILs和CSSLs群體脂肪酸含量表型分析

對2017—2018年2個群體親本及后代單株的脂肪酸各組分含量和油分總量進行基本統(tǒng)計分析（表1）。2年的RILs、CSSLs群體母本的棕櫚酸、硬脂酸和油酸含量均低于父本，而亞油酸和亞麻酸含量均高于父本，RILs群體2個親本的油酸含量差異較大，而CSSLs群體2個親本的油酸、亞油酸含量差異較大。后代群體的5種脂肪酸含量中除硬脂酸的平均值比親本高，其余性狀的平均值均位于兩親本之間，并且具有雙向超親的現象。這5種脂肪酸在RILs和CSSLs 2個群體中均存在較大變異，變異系數為1.13%—6.99%，其中，亞油酸的變異系數（coefficient of variation，CV）最小，為1.76%—2.31%；硬脂酸的變異系數（CV）最大，為3.91%—6.99%，2017年RILs群體的變異系數達到6.99%；油酸的變異系數僅次于硬脂酸，表明硬脂酸和油酸在后代群體具有較大差異，提高其在大豆5種脂肪酸組分中所占的比例具有一定意義。同一群體中5種脂肪酸各組分最大值和最小值差異較明顯，說明在后代分離群體中的表現分離程度較大，且變異連續(xù)，是屬于多基因控制的數量性狀，受基因和環(huán)境的共同影響。

黑色箭頭代表RILs群體和CSSLs群體的父本Charleston和野生豆（ZYD00006）油分總量所在位置，紅色箭頭代表RILs群體和CSSLs群體的母本東農594和綏農14油分總量所在位置

對2017—2018年RILs和CSSLs群體的5種脂肪酸含量進行相關性分析（表2和表3），表明2個群體中5種脂肪酸含量相關性的趨勢一致，其中，油酸與棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸呈顯著負相關；棕櫚酸與硬脂酸、亞油酸和亞麻酸呈顯著正相關，亞油酸與亞麻酸呈顯著正相關。其中，油酸和亞油酸的相關系數最大，2018年RILs群體中達到-0.939，2017年CSSLS群體中達到-0.991，說明可以通過對油酸或亞油酸的選擇，從而達到對另一種成分的選擇。

2.3 大豆脂肪酸含量QTL定位

基于所構建的大豆遺傳連鎖圖譜，采用Win-QTLCart2.5和ICIM Mapping軟件分別對RILs和CSSLs群體進行QTL定位（表4和表5），2017—2018年的2個群體共定位到54個與脂肪酸組分相關的QTL，RILs和CSSLs群體分別定位到34和20個QTL，分布在除B2、C1、G、H、J、M和O以外的13個連鎖群上，其中，以N連鎖群上最多，有10個QTL；其次是A1連鎖群上，有8個QTL；而A2和L連鎖群上均只有1個。

檢測到與棕櫚酸相關的QTL共有12個，RILs群體檢測到10個QTL分別位于A1、C2、D1b、E、F和N等6個連鎖群上，貢獻率為6.47%—13.50%，LOD值為2.64—5.60。其中，被檢測到位于E連鎖群上，QTL效應值較大，貢獻率為13.50%。CSSLs群體檢測到2個QTL都位于N連鎖群上，表型貢獻率為4.62和7.75，LOD值為2.86和6.87。

檢測到6個與硬脂酸相關的QTL，其中RILs群體有4個QTL，分布在D1b、D2、F和N等4個連鎖群上，貢獻率為6.90%—11.11%，LOD值為2.84—4.51。其中，被檢測到位于F連鎖群上，QTL效應值較大，貢獻率為11.11%；CSSLs群體檢測到2個QTL分別位于C2和D1b連鎖群上，表型貢獻率為3.21和5.00，LOD值為1.78和2.95。

表1 2個群體親本和后代單株脂肪酸含量的基本統(tǒng)計

PA：棕櫚酸；SA：硬脂酸；OA：油酸；LA：亞油酸；LNA：亞麻酸。下同

PA: Palmitic acid; SA: Stearic acid; OA: Oleic acid; LA: Linoleic acid; LNA: Linolenic acid. The same as below

表2 RILs群體脂肪酸含量的相關分析

對角線下方為2017年RILs和CSSLs群體各脂肪酸之間的相關系數，上方為2018年RILs和CSSLs群體各脂肪酸之間的相關系數；**：表示在＜0.01水平上顯著相關。下同

Below the diagonal line is the correlation coefficient between the fatty acids in the RILs and CSSLs populations in 2017, and above is the correlation coefficient between the fatty acids in the RILs and CSSLs populations in 2018; **: indicates a significant correlation at the＜0.01 level. The same as below

表3 CSSLs群體脂肪酸含量的相關分析

表4 RIL群體脂肪酸含量QTL定位

表5 CSSL群體脂肪酸含量QTL定位

檢測到與油酸相關的QTL共有10個，其中RILs群體檢測到7個QTL分別位于A1、D1a、D2、和N等4個連鎖群上，貢獻率為5.64%—9.43%，LOD值為2.65—3.94；CSSLs群體檢測到3個QTL分別位于D2、E和F連鎖群上，表型貢獻率為4.49%、5.22%和8.80%，LOD值為2.75、3.98和9.60。

檢測到8個與亞油酸相關的QTL，其中RILs群體有6個QTL，分布在A1、I、K、L和N等5個連鎖群上，貢獻率為6.40%—8.34%，LOD值為2.54—3.26；CSSLs群體檢測到2個QTL都位于A1連鎖群上，表型貢獻率為22.09%和4.28%，LOD值為11.65和2.59。其中，被檢測到位于A1連鎖群上，QTL效應值較大，貢獻率為22.09%。

檢測到11個與亞麻酸相關的QTL，其中RILs群體有5個QTL，分布在B1、I、K和N等4個連鎖群上，貢獻率為7.74%—13.49%，LOD值為3.20—5.46，其中被檢測到位于K連鎖群上，QTL效應值較大，貢獻率為13.49%；CSSLs群體檢測到6個QTL分別位于A1、A2、E、F和K等5個連鎖群上，表型貢獻率為2.92%—5.86%，LOD值為2.31—5.51。

檢測到7個與油分相關的QTL，其中RILs群體有2個QTL，分布在D1b和F等2個連鎖群上，貢獻率為6.95%和10.04%，LOD值為2.67和3.79，其中被檢測到位于F連鎖群上，QTL效應值較大，貢獻率為10.04%；CSSLs群體檢測到5個QTL分別位于A1、C2、D1a、F和N等5個連鎖群上，表型貢獻率為3.02%—8.14%，LOD值為1.84—3.67。

2.4 RIL和CSSL群體QTL分析結果比較

2017—2018年RIL和CSSL群體共定位到54個QTL，分布在13個連鎖群上，在同一群體中被重復檢測到的QTL有10對，分別位于A1、B1、C2、D1a、D2、F、K和N連鎖群上（表4、表5和圖4）。在RILs群體中重復檢測到的QTL有6對，其中，在A1 和D2連鎖群上有2對QTL，均連續(xù)2年被重復檢測到與油酸相關，說明這是2對是油酸相關的穩(wěn)定QTL；在B1連鎖群上的1對QTL同樣連續(xù)2年被重復檢測到與亞麻酸相關，分別解釋了7.74%和9.89%的貢獻率，說明該QTL是與亞麻酸相關的穩(wěn)定QTL；另外在F連鎖群上定位到的3個QTL，與棕櫚酸、硬脂酸和油分均相關，定位在同一區(qū)間內，且位置相同，說明為棕櫚酸、硬脂酸和油分含量重疊的QTL，可能調控多種脂肪酸的合成；定位在連鎖群K上的1對QTL，檢測與亞油酸、亞麻酸相關，說明該QTL可能會調控多種脂肪酸的合成；定位在連鎖群N上的1對QTL，檢測為油酸和亞油酸含量重疊的QTL，說明該QTL可能會調控多種脂肪酸的合成。

：2017年RIL群體定位到的QTL；：2018年RIL群體定位到的QTL；：2017年CSSL群體定位到的QTL；：2018年CSSL群體定位到的QTL

在CSSLs群體中被重復檢測的有4對。定位在N連鎖群上的3個QTL，其中和連續(xù)2年被重復檢測到并與棕櫚酸相關，說明可能是棕櫚酸相關的穩(wěn)定QTL，同時又與油分相關的為同一個QTL，說明其為棕櫚酸和油分含量重疊的QTL，并且能夠調控多種脂肪酸的合成，值得關注；定位在C2連鎖群上的1對QTL和定位在D1a連鎖群上的1對QTL，均為硬脂酸和油分含量重疊的QTL，說明可能是調控多種脂肪酸合成的QTL；在A1連鎖群上有3個QTL，其中和連續(xù)2年被檢測到并與亞油酸相關，并且在2017年表型貢獻率達到了22.09%，說明可能是亞油酸相關的穩(wěn)定QTL，同時又與油分相關的為同一個QTL，說明其為亞油酸和油分含量重疊的QTL，可能是控制大豆脂肪酸含量的重要位點。

對不同群體定位到的脂肪酸組分的QTL進行比較發(fā)現，N連鎖群上檢測到的QTL最多，并且5種脂肪酸的QTL均被檢測到，說明可能較多的與脂肪酸相關的QTL定位在該連鎖群上。RILs群體的與CSSLs群體的被檢測定位在A1連鎖群上，且區(qū)間較近，可能為同一個QTL，可能是一個在不同群體中能夠穩(wěn)定遺傳的QTL，定位結果需進一步驗證。

2.5 候選基因挖掘及富集分析

通過對RILs和CSSLs群體的5種脂肪酸和油分總量進行的QTL定位，定位到54個QTL，對QTL定位所獲得的區(qū)間進行候選基因的挖掘及GO富集數據分析。從基因注釋數據集[35]中發(fā)現有9個區(qū)間不含基因，共篩選出485個候選基因，對具有GO注釋的候選基因進行進一步的GO富集數據分析，如表6所示，有15個基因與大豆脂肪酸的形成直接或間接相關。這15個候選基因都在脂肪酸的合成或分解過程中發(fā)揮重要作用。其中候選基因與?；o酶a/酰基轉移酶有關，能夠調節(jié)脂肪酸鏈的延伸，影響脂肪酸的合成[36-37]；編碼植物酰基-?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）硫酯酶，ACP的特異性決定了大多數植物組織中飽和脂肪酸的水平[36,38]，候選基因對脂肪酸的形成非常重要，這兩個基因都與脂肪酸合成的調控有關。候選基因編碼磷脂酶D1，已被證實磷脂酶D在甘油磷脂的代謝中起重要作用[39]；候選基因與二羥基丙酮激酶/FAD還原酶有關，是甘油醛生產的重要介質，與脂類的甘油代謝過程有關[40]，這兩個基因主要影響脂質代謝，從而調節(jié)植物組織中的脂肪酸含量。候選基因、和都與乙醇乙?；D移酶有關，是脂肪酸合成途徑中的重要催化劑[41]。候選基因編碼一種脂肪酸-羥化酶，通過介導長鏈脂肪酸轉化為ω-羥基脂肪酸，影響角質、軟木脂和蠟的生物合成[42]。是丙酮酸激酶家族蛋白成員，丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的一種限速酶，能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸的相關反應，而丙酮酸又是三羧酸循環(huán)的前體物質，參與物質代謝和氨基酸合成等多種生理生化反應[43]，有研究發(fā)現，丙酮酸激酶有調節(jié)與控制光合作用的產物轉化為油脂的作用[44]、是催化光合產物生成油脂的關鍵酶[45]。另外編碼脂肪酸去飽和酶，而與酮酸脫羧酶有關，、、和4個候選基因都與脂肪酶/?；饷赣嘘P，這幾個基因編碼的蛋白質在幾個方面影響脂肪酸含量。

3 討論

本研究進行基因精細定位所利用的染色體片段代換系（CSSLs）群體，已成功應用在包括水稻、玉米等作物中[46-48]。CIM和ICIM是QTL定位的重要方法，廣泛應用于大豆性狀的QTL定位中，CIM能夠克服區(qū)間作圖法連鎖背景的影響；而ICIM能夠解決QTL算法上的缺陷，充分利用所有標記，本研究同時運用了這兩種QTL定位方法，以期能獲得較為準確的QTL[19-21]。對2個群體的5脂肪酸的相關性分析結果：棕櫚酸與硬脂酸、亞油酸、亞麻酸呈顯著正相關，而油酸與其余4種組分均呈顯著負相關；與于福寬[49]研究結果相同，說明5種脂肪酸之間的相關性穩(wěn)定，可以在以后的大豆品質改良研究中作為參考。

表6 基因注釋候選基因

本研究于2017—2018年在2個群體中共定位到54個QTL，與目前報道的脂肪酸相關的QTL結果比較，發(fā)現2個群體可能共有5個QTL區(qū)間與前人結果相近，其中，在D1a連鎖群上定位到的區(qū)間與盛英華等[30]相近，但表型解釋率較低，為6.95%；在D2連鎖群上定位到的區(qū)間與盛英華等[30]、朱明月[50]的定位結果相近，這個區(qū)間存在2個與油酸相關的QTL，其中的表型解釋率較高，為9.4%，可能是一個穩(wěn)定的QTL區(qū)間且與油酸相關；在E連鎖群上定位到的區(qū)間與DIERS等[51]的相同，且位置相近可能是同一個QTL，其中和的表型解釋率較高，分別為13.5%和9.4%，可能是一個穩(wěn)定的QTL，并且該區(qū)間與多種脂肪酸相關；在L連鎖群上定位的區(qū)間與HYTEN等[52]的相近，但表型解釋率較低，為7.26%；在I連鎖群上定位到的區(qū)間在FAN等[29]定位的區(qū)間內，推測有多種脂肪酸相關的QTL分布在這一區(qū)間內。本研究定位到的QTL從貢獻率上來說，大部分是一些微效的QTL，可能是由于雙親與后代群體的脂肪酸各組分和油分的變異系數較小，最大變異系數僅為6.99%（表1），微效基因較多與雙親和后代群體的表型差異較小有關。除了部分QTL與已有的定位結果相近，同時發(fā)現了一些新的QTL區(qū)間，并且2個群體中共有10對QTL被多次重復檢測到，表現穩(wěn)定；同時還有部分的QTL區(qū)間存在重疊，并與多種脂肪酸組分相關，可能是由于一個基因可以影響生物多種性狀的表型，也可能是由于脂肪酸各組分QTL之間的緊密連鎖[30]；但能在2個群體重復檢測到的QTL較少，僅有1對?？傊?，本研究檢測到的部分QTL與前人定位的QTL區(qū)間一致，進一步驗證了本研究的可靠性；另一方面能在不同年份、不同群體中被重復檢測到的QTL區(qū)間和新發(fā)現的區(qū)間均是與大豆脂肪酸含量相關的重要區(qū)段，具有更高的利用價值。

進一步對所定位到的這些區(qū)間進行候選基因的挖掘及富集分析，一共有15個候選基因與脂肪酸相關，這些候選基因主要分布在第2、3、5、6和17染色體上，其中，基因被許多學者研究報道[36]，編碼植物?；??；d體蛋白（ACP）硫酯酶，說明該基因對脂肪酸的形成非常重要（GO：0006633）[36]；是丙酮酸激酶家族蛋白成員，其家族成員已在甘藍和擬南芥中被報道與脂肪酸代謝相關[53]；與?；o酶a/酰基轉移酶有關，輔酶A已經被多次報道參與飽和脂肪酸的生物合成[36-37,53]。此外，本研究在其他QTL的置信區(qū)間內發(fā)現許多未知功能基因，可能存在與大豆脂肪酸相關的基因，有待進一步探索。

4 結論

2017—2018年在RILs群體和CSSLs群體中分別定位到34和20個與脂肪酸含量相關的QTL。其中，有10對QTL在不同年份的2個群體中被重復檢測到，在RILs群體重復檢測到6對，在CSSLs群體中重復檢測到4對，并且與多種脂肪酸相關。檢測到15個候選基因與脂肪酸相關。

[1] QI Z M, ZHANG Z G, WANG Z Y, YU J Y, Qin H T, MAO X R, JIANG H W, XIN D W, YIN Z G, ZHU R S, LIU C Y, YU W, HU Z B, WU X X, LIU J, CHEN Q S. Meta-analysis and transcriptome profiling reveal hub genes for soybean seed storage composition during seed development. Plant Cell & Environment, 2018, 41(9): 2109-2127.

[2] Wilson R F. Soybean: market driven research needs//Genetics and Genomics of soybean. NewYork: Springer, 2008: 3-15.

[3] Bellaloui N, Bruns H A, Abbas H K, Mengistu A, Fisher D K, Reddy K N. Agricultural practices altered soybean seed protein, oil, fatty acids, sugars and minerals in the Midsouth USA. Frontiers in Plant Science, 2015, 6(31): 31-44.

[4] Spencer M, Pantalone V, Meyer E, Landau-Ellis D, Hyten D. Mapping the Fas locus controlling stearic acid content in soybean. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 106(4): 615-619.

[5] 左進華, 董海洲, 侯漢學. 大豆蛋白生產與應用現狀. 糧食與油脂, 2007, 5(5): 12-15.

ZUO J H, DONG H Z, HOU H X. Current status of soy protein production and application. Grains and fats, 2007, 5(5): 12-15. (in Chinese)

[6] 王連錚. 國內外大豆生產的現狀和大豆品種創(chuàng)新問題. 中國食物與營養(yǎng), 2006, 7(6): 6-9.

WANG L Z. The status quo of soybean production at home and abroad and the innovation of soybean varieties. Chinese food and nutrition, 2006, 7(6): 6-9. (in Chinese)

[7] 任波, 李毅. 大豆種子脂肪酸合成代謝的研究進展. 分子植物育種, 2005(3): 301-306.

REN B, LI Y. Research progress on fatty acid synthesis and metabolism of soybean seeds.Molecular Plant Breeding, 2005(3): 301-306. (in Chinese)

[8] Whigham L D, Watras A C, Schoeller D A. Efficacy of conjugated linoleic acid for reducing fat mass: a meta-analysis in humans. American Journal of Clinical Nutrition, 2007(5): 1203-1211.

[9] Tompkins C, Perkins E G. Frying performance of low-linolenic acid soybean oil. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2000, 77(3): 223-229.

[10] Slover H T, Lanza E. Quantitative analysis of food fatty acids by capillary gas chromatography. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1979, 56(12): 933-943.

[11] Stoffel W, Chu F, Ahrens Jr E H. Analysis of long-chain fatty acids by gas-liquid chromatography. Analytical Chemistry, 1959, 31(2): 307-308.

[12] Pazdernik D L, Killam A S, Orf J H. Analysis of amino and fatty acid composition in soybean seed, using near infrared reflectance spectroscopy. Agronomy Journal, 1997, 89(4): 679-685.

[13] Sato T, Kawano S, Iwamoto M. Near infrared spectral patterns of fatty acid analysis from fats and oils. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1991, 68(11): 827-833.

[14] Wood R, Lee T. High-performance liquid chromatography of fatty acids: quantitative analysis of saturated, monoenoic, polyenoic and geometrical isomers. Journal of Chromatography A, 1983, 254(JAN): 237-246.

[15] Aveldano M I, VanR ollins M, Horrocks L A. Separation and quantitation of free fatty acids and fatty acid methyl esters by reverse phase high pressure liquid chromatography. Journal of Lipid Research, 1983, 24(1): 83-93.

[16] 范勝栩, 李斌, 孫君明, 韓粉霞, 閆淑榮, 王嵐. 氣相色譜方法定量檢測大豆5種脂肪酸. 中國油料作物學報, 2015, 37(4): 548.

FAN S X, LI B, SUN J M, HAN F X, YAN S R, WANG L. Gas chromatography method for quantitative detection of 5 fatty acids in soybean.Chinese Journal of Oil Crops, 2015, 37 (4): 548. (in Chinese)

[17] 王芹, 馮景春, 馮開. 氣相色譜法及其應用. 廣東化工, 2014, 41(12): 202-208.

WANG Q, FENG J C, FENG K. Gas chromatography and its application. Guangdong Chemical Industry, 2014, 41(12): 202-208. (in Chinese)

[18] LI H H, YE G Y, WANG J K. A modified algorithm for the improvement of composite interval mapping. Genetics, 2007, 175(1): 361-374.

[19] Jansen R C. Interval mapping of multiple quantitative trait loci. Genetics, 1993, 135(1): 205-211.

[20] KAO C H, ZENG Z B, Teasdale R D. Multiple interval mapping for quantitative trait loci. Genetics, 2004, 152(3): 1987-2002.

[21] Rodolphe F, Lefort M. A multi-marker model for detecting chromosomal segments displaying QTL activity. Genetics, 1993, 134(4): 1277-1288.

[22] LI H H, Ribaut J M, LI Z L, WANG J K. Inclusive composite interval mapping (ICIM) for digenic epistasis of quantitative traits in biparental populations. Theoretical & Applied Genetics, 2008, 116(2): 243-260.

[23] 李慧慧. 數量性狀基因的完備區(qū)間作圖方法[D]. 北京: 北京師范大學, 2009.

LI H H. A complete interval mapping method for quantitative trait genes[D]. Beijing: Beijing Normal University, 2009. (in Chinese)

[24] Weller J I. Maximum likelihood techniques for the mapping and analysis of quantitative trait loci with the aid of genetic markers. Biometrics, 1986, 42(3): 627-640.

[25] Akond M, LIU S, Boney M, KANTARTZI S K, KASSEM M A. Identification of quantitative trait loci (QTL)underlying protein, oil, and five major fatty acids' contents in soybean. American Journal of Plant Sciences, 2014, 5(1): 158-167.

[26] QIN H T, LIU Z X, WANG Y Y, XU M Y, QI Z M. Meta-analysis and overview analysis of quantitative trait locis associated with fatty acid content in soybean for candidate gene mining.Plant Breed, 2018, 137(2): 181-193.

[27] LI B, FAN S X, YU F K, CHEN Y, ZHANG S R, HAN F X, YAN S R, WANG L Z, SUN J M. High-resolution mapping of QTL for fatty acid composition in soybean using specific locus amplified fragment sequencing. Theoretical & Applied Genetics, 2017, 130(7): 1467-1479.

[28] XIA N, WU D P, ZHAN Y H, LIU Y, SUN M Y, ZHAO X, TENG W L, HAN Y P. Dissection of genetic architecture for oil content in soybean seed using two backcross populations. Plant Breed,2017, 136(7): 365-371.

[29] FAN S X, LI B, YU F K, HAN F X, YAN S R, WANG L Z, SUN J M. Analysis of additive and epistatic quantitative trait loci underlying fatty acid concentrations in soybean seeds across multiple environments. Euphytica, 201, 206(3): 689-700.

[30] 盛英華, 張延瑞, 戴亞楠, 昝光敏, 周凱, 王賢智. 不同群體中大豆脂肪酸組分QTL定位研究. 中國油料作物學報, 2020(5): 796-806.

SHENG Y H, ZHANG Y R, DAI Y N, ZAN G M, ZHOU K, WANG X Z. QTL mapping of soybean fatty acid components in different populations. Chinese Journal of Oil Crops, 2020(5): 796-806. (in Chinese)

[31] CHEN Q S, ZHANG Z C, LIU C Y, XIN D W, QIU H M, SHAN D P, SHAN C Y, HU G H. QTL analysis of major agronomic traits in soybean. Scientia Agriculture Sinica, 2007, 6(4): 399-405.

[32] QI Z M, HUANG L, ZHU R S, XIN D W, LIU C Y, HAN X, JIANG H W, HONG W G, HU G H, ZHENG H K, CHEN Q S. A high-density genetic map for soybean based on specific length amplified fragment sequencing.PLoS ONE, 2014, 9(8): e104871.

[33] Xin D W, Qi Z M, Jiang H W, Zhang Z G, Zhu R S, Hu J H, HAN H Y, HU G H, LIU C Y, CHEN Q S. QTL locationand epistatic effect analysis of 100-seed weight using wild soybean (Sieb. & Zucc.) chromosome segment substitution lines. Plos ONE, 2016, 11(3): e0149380.

[34] Mccouch S R, Cho Y G, Yano M, PAUL E, BLINSTRUB M, MORISHIMA H, KINOSITA T. Report on QTL nomenclature. Rice Genetics Newsletter, 1997, 14: 11-13.

[35] JIANG H W, LI Y Y, QIN H T, LI Y L, QI H D, LI C D, WANG N N, LI R C, ZHAO Y Y, HAUNG S Y, YU J Y, WANG X Y, ZHU R S, LIU C Y, HU Z B, QI Z M, XIN D W, WU X X, CHEN Q S. Identification of major QTLs associated with first pod height and candidate gene mining in soybean. Frontiers in plant science, 2018, 9: 1280

[36] WANG X Y, LI Q Y, ZHANG Q, YU J Y, QIN H T, QI H D, LI Y L, LI Y Y, YIN Z G, HAN X, WU X X, XIN D W, CHEN Q S, QI Z M. Identification of soybean genes related to fatty acid content based on a soybean genome collinearity analysis.Plant Breeding, 2019, 138(6): 696-707.

[37] Baud S, Guyon V, Kronenberger J, WUILLEME S, MIQUEL M, CABOCHE M, LEPINIEC L, ROCHAT C. Multifunctional acetyl-CoA carboxylase 1 is essential for very long chain fatty acid elongation and embryo development in. The Plant Journal, 2010, 33(1): 75-86.

[38] Goettel W, Ramirez M, Upchurch R G, CHARLES Y Q. Identification and characterization of large DNA deletions affecting oil quality traits in soybean seeds through transcriptome sequencing analysis. Theoretical and Applied Genetics, 2016, 129(8): 1577-1593.

[39] Pettitt T R, Martin A, Horton T, LIOSSIS C, LORD J M, WAKELAM M. Diacylglycerol and phosphatidate generated by phospholipases C and D, respectively, have distinct fatty acid compositions and functions phospholipase d-derived diacylglycerol does not activate protein kinase c in porcine aortic endothelial cells. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(28): 17354-17359.

[40] Wilson C H, Shalini S, Filipovska A, RICHMAN T R, KUMAR S. Age-related proteostasis and metabolic alterations in Caspase-2-deficient mice. Cell Death & Disease, 2015, 6(1): e1597.

[41] Bartley I M, Stoker P G, Martin A D E, HATFIELD S G S, KNEE M. Synthesis of aroma compounds by apples supplied with alcohols and methyl esters of fatty acids. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36: 567-574.

[42] Koteles J. Fatty acid ω-hydroxylases in soybean[D].Canada Ontario: The University of Western Ontario, 2012.

[43] Ambasht P K, Kayastha A M. Plant pyruvate kinase. Biologia Plantarum, 2002, 45(1): 1-10.

[44] Andre C, Froehlich J E, Moll M R, BENNING C. A heteromeric plastidic pyruvate kinase complex involved in seed oil biosynthesis in. The Plant Cell, 2007, 19(6): 2006-2022.

[45] HUANG P Y, LUO L J. Effect on pyruvate kinase in high plants.Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009, 37(20): 9352-9354.

[46] 蔣洪蔚, 劉春燕, 高運來, 李燦東, 張聞博, 胡國華, 陳慶山. 作物QTL定位常用作圖群體. 生物技術通報, 2008, 1(20): 12-17.

JIANG H W, LIU C Y, GAO Y L, LI C D, ZHANG W B, HU G H, CHEN Q S. Crop QTL mapping is often used as a map population. Biotechnology Bulletin, 2008, 1(20): 12-17. (in Chinese)

[47] Ma X, Chen X P, Zhao J, WANG S S, TAN L B, SUN C Q, LIU F X. Identification of QTLs related to cadmium tolerance from wild rice () using a high-density genetic map for a set of introgression lines. Euphytica, 2019, 215(12): 1-12.

[48] 李晶晶, 王利鋒, 馬娟, 曹言勇, 王浩, 王麗艷, 賈騰蛟, 董春林, 李會勇. 基于昌7-2導入系發(fā)掘干旱脅迫下玉米產量相關QTL位點. 玉米科學, 2019, 27(4): 64-70.

LI J J, WANG L F, MA J, CAO Y Y, WANG H, WANG L Y, JIA T J, DONG C L, LI H Y. Discovery of QTLs related to maize yield under drought stress based on Chang 7-2 introduced line. Maize Science, 2019, 27(4): 64-70. (in Chinese)

[49] 于福寬. 大豆種質脂肪酸主要組分鑒定與QTL標記定位[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2011.

YU F K. Identification of the main fatty acid components of soybean germplasm and QTL mapping[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[50] 朱明月. 利用回交導入系群體定位大豆蛋白質、脂肪含量及脂肪酸含量QTL[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2017.

ZHU M Y. Using backcross introduction line population to locate soybean protein, fat content and fatty acid content QTL[D]. Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2017. (in Chinese)

[51] Diers B W, Keim P, Fehr W R, SHOEMAKER R C. RFLP analysis of soybean seed protein and oil content. Theoretical and Applied Genetic, 1992, 83(5): 608-612.

[52] Hyten D L, Pantalone V R, Saxton A M, SCHMIDT M E, SAMS C E. Molecular mapping and identification of soybean fatty acid modifier quantitative trait loci. Journal of the American Oil Chemists Society, 2004, 81(12): 1115-1118.

[53] 葉桑, 崔翠, 郜歡歡, 雷維, 王劉艷, 王瑞莉, 陳柳依, 曲存民, 唐章林, 李加納. 基于SNP遺傳圖譜對甘藍型油菜部分脂肪酸組成性狀的QTL定位. 中國農業(yè)科學, 2019, 52(21): 26-40.

YE S, CUI C, GAO H H, LEI W, WANG L Y, WANG R L, CHEN L Y, QU C M, TANG Z L, LI J N. QTL mapping of some fatty acid composition traits inbased on SNP genetic map. China Agricultural Sciences, 2019, 52(21): 26-40. (in Chinese)

Mapping QTL for Soybean Fatty Acid Composition Based on RIL and CSSL Population

QU KeXin, HAN Lu, XIE JianGuo, PAN WenJing, ZHANG ZeXin, XIN DaWei, LIU ChunYan, CHEN QingShan, QI ZhaoMing

Soybean Genetic Improvement Laboratory, College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030

【】Soybeans () originated from China. High-quality soybeans are widely used in various processing industries such as food, feeding, textiles, etc. Therefore, high-quality soybean breeding is a key point for soybean breeders and producers. This study conducted QTL mapping of each component of soybean fatty acid and screening of candidate genes, which would lay the molecular foundation for soybean quality improvement. 【】A recombinant inbred lines (RILs) population crossed by Charleston (American soybean varieties ) and Dongnong 594, and a chromosome segment substitution lines (CSSLs) population crossed by Suinong 14 (cultivated soybean) and ZYD00006 (wild soybean) were used for QTL mapping. We used gas chromatography to determine the fatty acid content of these two populations. As the genetic maps have been published by the soybean genetic improvement laboratory of the Agricultural College of Northeast Agricultural University before, QTL mapping of soybean fatty acid components in RIL and CSL populations were performed by the Windows QTL Cartographer 2.5 and ICIMapping software. And the candidate genes were screened from the QTL interval. 【】Based on 2017 to 2018 years data, 34 and 20 QTLs related to fatty acid components were mapped in the RIL population and the CSSL population, respectively. These QTLs distribute in 13 linkage groups except B2, C1, G, H, J, M, and O. QTL mapping of the two populations was compared that ten pairs of QTLs were detected in the two populations. We found that QTLs distributed in the A1, C2, D1a, F, K, and N linkage groups were related to the content of multiple fatty acids components. An overlapping QTL related to linoleic acid and oil content was detected on the A1 linkage group, QTL related to stearic acid and oil content on the C2, QTL related to stearic acid and oil content on the D1a, QTLs related to palmitic acid, stearic acid and oil content on the F, QTLs related to linoleic acid and linolenic acid content on the K, QTLs related to palmitic acid and oil content, and QTL related to oleic acid and linoleic acid content on the N. Candidate genes were screened out from QTL intervals. In total, 485 candidate genes were screened from the gene annotation data set and 271 of them annotated within GO annotations. GO enrichment analysis showed that 15 candidate genes involved in fatty acids pathway. These genes affect synthesis of fatty acids mainly through encoding plant acyl carrier protein (ACP) thioesterase, fatty acid desaturase, phospholipase D1, fatty acid-hydroxylase and pyruvate kinase, participating in the biosynthesis of acyl-CoA, and regulating the extension of fatty acid chain. 【】54 QTLs related to soybean fatty acid were detected, and 10 pairs QTLs were stable detected from the two mapping populations. We used the confidence intervals from QTL mapping to screen candidate genes, and 15 candidate genes related to fatty acids pathway were screened out. These stable QTLs and candidate genes can be used for molecular marker-assisted selection of soybean fatty acid improvement.

soybean; introduction line; gas chromatography; QTL mapping; gene mining; enrichment analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.003

2021-02-03；

2021-03-22

國家自然科學基金（31701449）、東北農業(yè)大學青年人才骨干項目（18XG01）

渠可心，E-mail：18145648226@163.com。通信作者陳慶山，E-mail：qshchen@126.com。通信作者齊照明，E-mail：qizhaoming1860@126.com

（責任編輯 李莉）