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        畜禽產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留測定方法優(yōu)化

        2021-08-20 04:26:02藍(lán)棋浩余軍軍陳秋月
        畜禽業(yè) 2021年8期
        關(guān)鍵詞:萃取柱提取液凈化

        藍(lán)棋浩,余軍軍,寧 軍,韋 田,陳秋月

        (溫氏食品集團(tuán)有限公司,廣東 云浮 527400)

        0 引言

        喹乙醇又名培育諾、快育靈,是一種化學(xué)合成的飼料添加劑,具有促進(jìn)蛋白同化,提高飼料轉(zhuǎn)化率,加速生長,增加經(jīng)濟(jì)效益等作用;同時擁有廣譜抗菌效果,所以廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)品養(yǎng)殖。經(jīng)研究表明,喹乙醇會在體內(nèi)存積,對大多數(shù)動物有明顯的致畸作用。因此,大多數(shù)國家都禁止在畜禽與水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用該藥,同時在《中國獸藥典》(2005版)也有明確規(guī)定,喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖[1]。

        喹乙醇在體內(nèi)不穩(wěn)定,能快速代謝成幾種物質(zhì),其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)在體內(nèi)相對穩(wěn)定,被公認(rèn)為喹乙醇代謝殘留標(biāo)識物[2-3]。MQCA的檢測方法已有很多文獻(xiàn)報道,其中最常用的提取與檢測是采用酶解衍生,固相萃取柱凈化。該方法存在前處理操作復(fù)雜、回收率低、檢出限高,不利于大批量檢測。通過研究對比,本實驗采用2%偏磷酸甲醇(4:1)溶液酸化提取[4],采用固相萃取柱凈化,基質(zhì)干擾很少,同時回收率在75.4%~105%,檢出限達(dá)到0.1 μg/kg,大大節(jié)省了檢測時間,提高了工作效率。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(ABSCIEX-QTRAP 5500)、電子天平(JJ200)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf-5804R)、純水機(jī)(Rephile-RS2200QSS)、氮吹儀(LabTech-MV5)、多功能振蕩儀(IKA-KS501)、超聲機(jī)(JP-100)、OasisMAX固相萃取柱(150 mg/6 mL,Waters公司)。

        3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司,純度99.24%,批號G1012840);3-甲基喹噁啉-2-羧酸-D4(MQCA-D4)(CATO公司,純度99.7%,批號B9360028)。

        甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,氨水和偏磷酸均為分析純。

        1.2 試劑配置

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配置

        精確稱取10 mg MQCA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中,配制成1.0 mg/mL MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

        1.2.2 內(nèi)標(biāo)儲備液配置

        精確稱取10 mg MQCA-D4標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中,配制成1.0 mg/mL MQCA-D4標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20℃下避光保存。

        1.2.3 2%偏磷酸甲醇溶液

        準(zhǔn)確稱取20 g偏磷酸到容量瓶中,用超純水定容至1 000 mL,搖勻后2% 偏磷酸與甲醇體積比4:1混勻至燒杯中,即得2%偏磷酸甲醇溶液。

        1.2.4 1 mmol/L氨水-甲醇(體積比4:1)溶液

        在200 mL水中加入15 μL的濃氨水,混合均勻即得1 mmol/L氨水溶液,再加入50 mL甲醇混勻,即得1 mmol/L氨水-甲醇混合液。

        1.2.5 2%甲酸乙酸乙酯溶液

        150 mL乙酸乙酯中加入4 mL甲酸,再加乙酸乙酯稀釋到200 mL。

        1.3 試驗方法與結(jié)果

        1.3.1 樣品前處理

        稱取5 g(精確至0.01 g)均質(zhì)樣品置于50 mL離心管中,加入8 mL 2%偏磷酸-甲醇提取液,渦旋振蕩1 min,超聲10 min,水平振蕩10 min,9 000 r/min離心5 min,將上清液移入50 mL離心管中,殘渣加入8 mL 2%偏磷酸-甲醇提取液重復(fù)提取,合并2次提取液,10 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液置50 mL離心管,上清液備用。

        固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化,上清液全部過萃取柱。依次用5 mL水、5 mL 1 mmol/L氨水-甲醇(4:1)溶液、5 mL甲醇淋洗,抽干1 min,用5 mL 2%甲酸乙酸乙酯洗脫,氮氣45℃吹干,加入1 mL 0.1%甲酸水:甲醇(9:1,v/v)溶解,漩渦混勻后,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,上機(jī)測定。

        1.3.2 色譜條件

        色譜柱:Waters公司XBridge C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,3.5 μm),流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為甲醇,流速為0.3 mL/min;梯度洗脫程序見表1;柱溫40℃,進(jìn)樣量10 μL。

        表1 梯度洗脫程序

        1.3.3 質(zhì)譜條件

        通過MRM模式,在電噴霧離子源正離子檢測模式下進(jìn)行掃描,分別對MQCA和MQCA-D4進(jìn)行優(yōu)化,參照藥物的信噪比優(yōu)化最佳去簇電壓和碰撞能量,獲得最佳優(yōu)化條件。源溫:550℃,電噴霧電壓:5 500 V,碰撞氣:Low,氣簾氣:35 psi,輔助氣1:50 psi,輔助氣2:50 psi。質(zhì)譜條件見表2,MQCA色譜圖見圖1、圖2。

        表2 其他質(zhì)譜參數(shù)匯總表

        圖1空白雞肉色譜圖

        圖2空白雞肉中MQCA添加濃度為1ng/kg的色譜圖

        1.3.4 線性方程與檢出限

        分別配置標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為:0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL,內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL進(jìn)行分析,標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1~20 ng/mL范圍內(nèi)線性范圍良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=0.247 10X-0.010 49(r=0.999 3)。

        以加標(biāo)樣本中待測化合物色譜峰的信噪比(S/N)大于或等于3對應(yīng)的濃度確定方法檢出限,當(dāng)濃度為0.5 ng/mL時,信噪比S/N=97.7,滿足要求,故本方法的檢出低限為0.1 μg/kg,比國家標(biāo)準(zhǔn)方法中的0.5 μg/kg提高5倍,證明了本方法靈敏度高。

        1.3.5 回收率試驗及精密度

        取空白樣品,通過加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其空白添加濃度為0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg,分別測度其回收率,實驗表明,在0.5~2 μg/kg范圍內(nèi),動物源性食品中MQCA的回收率在75%~105%,批間與批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%?;厥章始熬芏纫姳?。

        2 分析與討論

        2.1 提取方式的優(yōu)化

        由于喹乙醇代謝物在體內(nèi)是與蛋白質(zhì)通過結(jié)合狀態(tài)存在的,首先要將喹乙醇代謝物從組織中游離出來。目前文獻(xiàn)報道常用的方法有酸解法、堿解法和酶解法[1-7],并且MQCA有弱酸性,因此偏磷酸溶液能將其游離出來。本實驗通過偏磷酸+甲醇[3]混合溶液能使樣品中MQCA充分提取出來,再結(jié)合超聲、振蕩,能將其提取效率最大化。

        2.2 凈化方式的優(yōu)化

        通常凈化方式有2種,一種是通過有機(jī)溶劑提取和氮氣吹干濃縮;另一種是采用固相萃取柱凈化濃縮。筆者曾嘗試在提取液中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取[4],再將有機(jī)層氮氣吹干,但是基質(zhì)干擾嚴(yán)重,特別是在豬肝中會出現(xiàn)一個干擾雜鋒與目標(biāo)峰重疊,而且目標(biāo)峰響應(yīng)低,無法達(dá)到要求,故采用固相萃取法進(jìn)行凈化。

        表3 動物源性食品中三種加標(biāo)濃度回收率及精密度

        2.3 固相萃取柱的選擇

        目前國家標(biāo)準(zhǔn)中均采用混合型陰離子交換固相萃取柱(MAX柱)凈化,該萃取小柱能從復(fù)雜的樣品中提取出酸性化合物保留在柱內(nèi),通過酸性有機(jī)相溶液洗脫出來,同時該柱pH最佳應(yīng)用范圍在2~8。筆者曾對比過提取液分別為:0.3 mol/L鹽酸溶液和2%偏磷酸甲醇混合液提取樣品,測試其pH值分別為0.2和2.6,經(jīng)過MAX小柱凈化,濃縮復(fù)溶上機(jī)測定對比,當(dāng)提取液為0.3 mol/L鹽酸溶液時,回收率為40%~60%;當(dāng)提取液為2%偏磷酸甲醇混合液時,回收率為75%~98%。因此提取液使用2%偏磷酸甲醇混合液最佳,同時提取液有16 mL,故MAX柱采用高通量的規(guī)格(150 mg/6 mL),避免出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象。

        3 結(jié)論

        本方法建立了畜禽產(chǎn)品中喹乙醇代謝物(MQCA)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品經(jīng)過酸化提取、凈化,有效地消除了基質(zhì)干擾,方法具有較高的靈敏度,以MQCA-D4作為內(nèi)標(biāo),提高了定量準(zhǔn)確性。經(jīng)過驗證,一系列濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r≥0.999;方法檢測低限為0.1 μg/kg;在0.5~2 μg/kg添加水平回收率75%~105%,批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于10%。通過回收率和多種食品樣品檢測表明,該方法前處理簡單、便捷,靈敏度高,相比國標(biāo)GB/T 20746-2006和SNT0197-2014具有靈敏度、回收率高、耗時短等特點,適用于畜禽產(chǎn)品中喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的檢測。

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