曹揚(yáng)，王瑩

吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染致全球超過2.5億人罹患多種肝病，每年約140萬人死于HBV相關(guān)疾病，包括肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌［1-2］。目前，已批準(zhǔn)的HBV感染治療藥物僅為核苷酸類似物和干擾素（interferon，IFN）［3］，細(xì)胞內(nèi)抗病毒因子用于治療HBV感染尚處于研發(fā)階段，是HBV領(lǐng)域重要的基礎(chǔ)研究之一。Na+／K+ATPaseβ1亞基（ATP1B1）作為細(xì)胞Na+／K+ATPase調(diào)節(jié)亞基的主要組分，不僅調(diào)控其自身活性，還參與T細(xì)胞活化［4］。有研究表明，Na+／K+ATPaseβ亞基與某些病毒感染有關(guān)，如ATP1B1可作為人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）UL136蛋白及甲、乙型流感病毒M2蛋白的伴侶調(diào)控病毒復(fù)制［5-7］；β3亞基可降低HeLa細(xì)胞中骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原-2（bone marrow stromal cell antigen-2，BST-2）介導(dǎo)的人類免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）產(chǎn)生的限制［8］，還可與腸道病毒71（enterovirus 71，EV71）的3A蛋白相互作用，通過增強(qiáng)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生來抑制EV71復(fù)制［9］。

維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白-Ⅰ（retinoic acid-inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）和黑色素瘤分化相關(guān)抗原5（melanoma differentiation-associated 5，MDA5）是細(xì)胞內(nèi)識(shí)別病毒異常mRNA的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，在天然免疫反應(yīng)中具有重要作用［10-11］。研究表明，RIG-Ⅰ主要識(shí)別5′端帶三磷酸基團(tuán)的RNA（包括單鏈和雙鏈RNA）和短的雙鏈RNA；MDA5主要識(shí)別普通的雙鏈RNA或poly（I:C）。未感染病毒的條件下，RIG-Ⅰ和MDA5的上調(diào)也可促進(jìn)細(xì)胞分泌Ⅰ型IFN，可啟動(dòng)下游IFN誘導(dǎo)基因（interferon stimulated gene，ISG）的表達(dá)，其中包括較多天然抗病毒因子，如ISG15、ISG56、GBPs、OASs和BST-2等，對(duì)不同病毒具有拮抗作用［12-15］。本研究通過建立過表達(dá)和沉默ATP1B1的HepG2細(xì)胞模型，探討ATP1B1對(duì)細(xì)胞中HBV復(fù)制的影響，為尋找抗HBV的新治療靶點(diǎn)和方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒及基因 HepG2（No.77400，ATCC）、HepG2.2.15、HepAD38細(xì)胞、質(zhì)粒VR1012-ATP1B1（由cDNA文庫(kù)獲取帶有HA標(biāo)簽的ATP1B1基因，插入至載體VR1012）及載體VR1012由吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科保存并提供；穩(wěn)定表達(dá)HBV的質(zhì)粒pHBV1.3（D基因型）由上海復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李建華教授惠贈(zèng)；siRNA ATP1B1及siRNA NC序列均由廣州市銳博生物科技有限公司合成。

1.2 主要試劑 鼠抗HA單克隆抗體（901514）購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；鼠抗β-tubulin單克隆抗體（A00702-100）購(gòu)自北京銳抗生物科技有限公司；兔抗ATP1B1單克隆抗體（ab193669）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（111-055-045）及羊抗鼠IgG（115-055-003）購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；HBsAg診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司；Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit購(gòu)自瑞士Roche公司；CCK8試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2、HepG2.2.15、HepAD38細(xì)胞按（1～2）×106個(gè)／孔分別接種至6孔板，用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI中登錄的HBV、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-28a、IL-29、OAS2、BST-2、ISG56、ISG15基因序列（登錄號(hào)分別為：NC_003977、NM_024013、NM_002176、NM_000619、NM_172138、NM_172140、NM_001032731、NM_004335、NM_001548、NM_005101），應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.5 過表達(dá)A T P1B1對(duì)H B V復(fù)制影響的檢測(cè) 采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將400 ng質(zhì)粒pHBV1.3分別與400 ng質(zhì)粒VR1012-ATP1B1及載體VR1012共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)4 h；更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)48h，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。

1.5.1 細(xì)胞中ATP1B1的表達(dá) 采用Western blot法。用RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)12%SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜，用脫脂牛奶于室溫封閉0.5 h；加入兔抗ATP1B1單克隆抗體（1∶1 000稀釋）及鼠抗β-tubulin單克隆抗體（1∶2 000稀釋），于4℃作用過夜；用PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG（均1∶2 000稀釋），于4℃作用1 h；將NC膜與堿性磷酸酶底物BCIP和NBT反應(yīng)8 mim顯色。

1.5.2 培養(yǎng)上清中HBsAg抗原含量檢測(cè) 采用HBsAg診斷試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的HBsAg含量，重復(fù)檢測(cè)3次。

1.5.3 細(xì)胞中HBV DNA及RNA含量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。用Trizol提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Transcriptor First Strand cDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1μL，HBV DNA-RT-F／R或HBV RNA-RT-F／R引物（10μmol／L）各0.4μL，SYBR 9.2μL，H2O 9μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以樣品的2-△△Ct值作為目標(biāo)基因的DNA及RNA含量。重復(fù)檢測(cè)3次。

1.6 A T P1B1表達(dá)量對(duì)H epG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中H Bs A g含量影響的檢測(cè) 按1.5項(xiàng)方法將400ng質(zhì)粒pHBV1.3分別與0、200、400、800 ng的質(zhì)粒VR1012-ATP1B1共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，按1.5.1和1.5.2項(xiàng)方法分別檢測(cè)細(xì)胞中ATP1B1蛋白的表達(dá)和培養(yǎng)上清液中的HBsAg含量。

1.7 沉默A T P1B1對(duì)H B V復(fù)制影響的檢測(cè) 按1.5項(xiàng)方法將400 ng質(zhì)粒pHBV1.3分別與100 nmol／L siRNA ATP1B1及siRNA NC序列共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，按1.5.1、1.5.2及1.5.3項(xiàng)方法分別檢測(cè)HepG2細(xì)胞中ATP1B1蛋白的表達(dá)、培養(yǎng)上清中HBsAg含量及細(xì)胞中HBV DNA、RNA含量。

1.8 過表達(dá)及沉默A T P1B3對(duì)H epG2細(xì)胞增殖影響的檢測(cè) 按1.5項(xiàng)方法將siRNA ATP1B1及質(zhì)粒VR1012-ATP1B1分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染0、24，48，72 h后，采用CCK8試劑盒測(cè)定A450，并按下式計(jì)算相對(duì)細(xì)胞增殖率。

相對(duì)細(xì)胞增殖率（%）=（轉(zhuǎn)染組A450-未轉(zhuǎn)染組A450）／未轉(zhuǎn)染組A450×100%

1.9 過表達(dá)A T P1B1對(duì)H B V復(fù)制影響的驗(yàn)證 按1.5項(xiàng)方法將質(zhì)粒VR1012-ATP1B1分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15及HepAD38細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后48 h，按1.5.1和1.5.2項(xiàng)分別檢測(cè)細(xì)胞中ATP1B1蛋白的表達(dá)和培養(yǎng)上清液中HBsAg含量。

1.10 過表達(dá)A T P1B1對(duì)H epG2細(xì)胞中細(xì)胞因子及P RR表達(dá)影響的檢測(cè) 按1.5項(xiàng)方法將400 ng質(zhì)粒VR1012-ATP1B1及載體VR1012分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFNα、IFNβ、IFNγ和IL-28A、IL-29的mRNA含量，方法同1.5.3項(xiàng)，引物為IFNα-RT-F／R、IFNβ-RTF／R、IFNγ-RT-F／R、IL-28a-RT-F／R、IL-29-RT-F；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RIG-Ⅰ和MDA5蛋白表達(dá)，方法同1.5.1項(xiàng)，其中一抗為兔抗RIG-Ⅰ單克隆抗體和兔抗MDA5單克隆抗體，稀釋度為1∶1 000。

1.11 過表達(dá)A T P1B1對(duì)ISG表達(dá)影響的檢測(cè) 按1.5項(xiàng)方法將400 ng質(zhì)粒VR1012-ATP1B1及載體VR1012分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后，收集細(xì)胞，qRT-PCR法 檢 測(cè) 細(xì) 胞 內(nèi)ISG15、ISG56、OAS2、BST-2、GBP-1的mRNA含量，方法同1.5.3項(xiàng)，引物為ISG15-RT-F／R、ISG56-RT-F／R、OAS2-RT-F／R、BST-2-RT-F／R、GBP-1-RT-F／R。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)A T P1B1對(duì)H B V復(fù)制的影響 VR1012-ATP1B1組HepG2細(xì)胞中ATP1B1蛋白呈過表達(dá)，于相對(duì)分子質(zhì)量約35 000處可見其與兔抗ATP1B1單克隆抗體的特異性結(jié)合條帶，大小與預(yù)期相符；VR1012組未見目的蛋白條帶。見圖1。VR1012-ATP1B1組及VR1012組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量（A450）分別為0.83和0.16，VR1012-ATP1B1組比VR1012組下降了約80%（t=5.940，P＜0.01）。VR1012-ATP1B1組HepG2細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和RNA含量均明顯低于VR1012組（t分別為6.34和6.95，P均＜0.01），見圖2。

圖1 HepG2細(xì)胞中ATP1B1蛋白的過表達(dá)Fig.1 Overexpression of ATP1B1 in HepG2 cells

圖2 過表達(dá)ATP1B1的HepG2細(xì)胞中HBVDNA及RNA的含量Fig.2 HBV DNA and RNA contents in HepG2 cells overexpressing ATP1B1

2.2 A T P1B1表達(dá)量對(duì)H epG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中H Bs A g含量的影響 隨著質(zhì)粒VR1012-ATP1B1加入劑量的增大，ATP1B1表達(dá)量逐漸升高，見圖3。0、200、400、800 ng質(zhì)粒VR1012-ATP1B1組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量（A450）分別為0.92、0.54、0.27、0.18，隨著ATP1B1表達(dá)量的升高，與0 ng質(zhì)粒VR1012-ATP1B1組比較，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量逐漸降低（t分別為6.63、6.84、6.93，P均＜0.01）。表明ATP1B1對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性。

圖3 不同ATP1B1表達(dá)量的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg含量Fig.3 HBsAg contents in culture supernatant of HepG2 cells with various ATP1B1 expression levels

2.3 沉默A T P1B1對(duì)H epG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中H Bs A g含量的影響 siRNANC組HepG2細(xì)胞中可見ATP1B1蛋白表達(dá)，于相對(duì)分子質(zhì)量約35 000處可見其與兔抗ATP1B1單克隆抗體的特異性結(jié)合條帶，大小與預(yù)期相符；與siRNANC比較，siRNAATP1B1組ATP1B1表達(dá)水平下調(diào)。見圖4。siRNA ATP1B1組及siRNA NC組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量（A450）分別為2.10和0.61，siRNA ATP1B1組顯著高于siRNA NC組（t=8.04，P＜0.01），表明沉默ATP1B1可增加HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg的含量。siRNA ATP1B1組HepG2細(xì)胞中HBV DNA和RNA含量明顯高于siRNANC組（t分別為7.54和6.88，P＜0.01），見圖5。

圖4 HepG2細(xì)胞中ATP1B1蛋白的沉默表達(dá)Fig.4 Silencing of ATP1B1 expression in HepG2 cells

圖5 沉默ATP1B1的HepG2細(xì)胞中HBV DNA及RNA的含量Fig.5 HBV DNA and RNA contents in HepG2 cells in which ATP1B1 is silenced

2.4 過表達(dá)及沉默A T P1B3對(duì)H epG2細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時(shí)，3組HepG2細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞增殖率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為0.34、0.56、0.43，P均＞0.05），見圖6。表明轉(zhuǎn)染72 h內(nèi)，細(xì)胞活力不受ATP1B1過表達(dá)或沉默的影響。

圖6 過表達(dá)及沉默ATP1B3的HepG2細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞增殖率Fig.6 Relative proliferation rates of HepG2 cells in which ATP1B3 is overexpressed or silenced

2.5 過表達(dá)A T P1B1對(duì)H B V復(fù)制影響的驗(yàn)證 Hep-G2.2.15和HepAD38細(xì)胞中可見ATP1B1蛋白表達(dá)，于相對(duì)分子質(zhì)量約35 000處可見其與兔抗ATP1B1單克隆抗體的特異性結(jié)合條帶，大小與預(yù)期相符；未轉(zhuǎn)染組未見該條帶。見圖7。HepG2.2.15組、HepAD38組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量（A450）分別為0.38、0.32、0.75，HepG2.2.15組和HepAD38組顯著低于未轉(zhuǎn)染組（t分別為7.73和7.23，P均＜0.01）。

圖7 過表達(dá)ATP1B1的HepG2.2.15和HepAD38細(xì)胞中ATP1B1蛋白的表達(dá)Fig.7 ATP1B1 expression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells overexpressing ATP1B1

2.6 過表達(dá)A T P1B1對(duì)H epG2細(xì)胞中細(xì)胞因子及P RR表達(dá)的影響 與VR1012組比較，VR1012-ATP1B1組HepG2細(xì)胞中IFNα、IFNβ和IL-29 mRNA含量明顯升高（t分別為6.84、7.76、3.65，P分別為＜0.01、＜0.01、＜0.05），IFNγ和IL-28A mRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為0.32和1.43，P均＞0.05），見圖8。VR1012-ATP1B1組HepG2細(xì)胞中RIG-I和MDA5蛋白表達(dá)高于VR1012組，見圖9。表明ATP1B1通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗病毒PRRs，誘導(dǎo)Ⅰ和Ⅲ型IFN的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制HBV復(fù)制的功能。

圖8 過表達(dá)ATP1B1對(duì)HepG2細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.8 Effect of ATP1B1 overexpression on expression of cytokines in HepG2 cells

圖9 過表達(dá)ATP1B1對(duì)HepG2細(xì)胞中RIG-Ⅰ和MDA5表達(dá)的影響Fig.9 Effect of ATP1B1 overexpression on expressions of RIG-Ⅰand MDA5 in HepG2 cells

2.7 過表達(dá)A T P1B1對(duì)I S G表達(dá)的影響 與VR1012組比較，VR1012-ATP1B1組HepG2細(xì)胞中ISG15、ISG56、OAS2和BST-2 mRNA含量顯著升高（t分別為7.33、7.52、8.04、6.83，P均＜0.01），GBP-1 mRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.45，P＞0.05），見圖10。推測(cè)ATP1B1可通過誘導(dǎo)一系列ISG的表達(dá)發(fā)揮抗HBV作用。

圖10 過表達(dá)ATP1B1的HepG2細(xì)胞中ISG的表達(dá)水平Fig.10 Expression levels of ISG in HepG2 cells overexpressing ATP1B1

3 討論

HBV感染已成為長(zhǎng)期存在的全球性公共衛(wèi)生問題，隨著基因工程疫苗的生產(chǎn)和使用，乙肝疫苗的接種率逐年上升，HBV感染率呈下降趨勢(shì)，但每年仍有眾多患者死于HBV感染引發(fā)的各種肝病。因此，尋找抗病毒療法仍是治療HBV感染的重要研究方向之一［16］。

由于HBV缺少體外感染模型，本實(shí)驗(yàn)采用了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型，在肝細(xì)胞來源的細(xì)胞系HepG2和經(jīng)重組方法穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15、HepAD38細(xì)胞中，測(cè)定了過表達(dá)和沉默ATP1B1蛋白對(duì)于HBV復(fù)制的影響，結(jié)果顯示，ATP1B1過表達(dá)可下調(diào)HBV總DNA、RNA和胞外HBsAg的含量；沉默ATP1B1明顯增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和RNA的水平，同時(shí)誘導(dǎo)胞外HBsAg表達(dá)水平的上升。因此，ATP1B1具有拮抗HBV復(fù)制的功能。有報(bào)道表明，ATP1B1同家族蛋白可通過協(xié)同抗病毒因子BST-2和介導(dǎo)HBsAg的泛素化降解實(shí)現(xiàn)抗病毒作用［17］；另有研究發(fā)現(xiàn)，ATP1B3對(duì)HIV和EV71具有不同的調(diào)控作用［8-9］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ATP1B1與HBV作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，ATP1B1可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)模式受體RIG-Ⅰ和MDA5的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ和Ⅲ型IFN的表達(dá)，使肝細(xì)胞在ATP1B1的作用下，產(chǎn)生更多的ISG蛋白，最終實(shí)現(xiàn)抗HBV的功能。

IFN和ISG是天然免疫的重要因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATP1B1可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ⅰ和Ⅲ型IFN表達(dá)，其中Ⅲ型IFN表達(dá)較弱，同時(shí)，細(xì)胞中RIG-Ⅰ和MDA5的表達(dá)水平升高，推測(cè)ATP1B1可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)RIG-Ⅰ和MDA5調(diào)控IFN的表達(dá)，具體誘導(dǎo)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。IFN可通過JAK／STAT等通路誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ISG的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，一系列ISG的表達(dá)，可通過不同機(jī)制發(fā)揮抗病毒功能，如非允許性細(xì)胞中存在的載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G，該蛋白是機(jī)體內(nèi)在的抗病毒因子，其在HIV反轉(zhuǎn)錄過程中，利用其胞嘧啶脫氨酶的活性，使所形成的病毒負(fù)鏈cDNA中的胞嘧啶脫氨，降低病毒感染力［18］。BST-2則可通過將病毒粒子錨定在細(xì)胞膜上，限制病毒釋放實(shí)現(xiàn)抗HIV和HBV的功能［15］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)已知的抗病毒ISG進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATP1B1可誘導(dǎo)以Ⅰ型IFN誘導(dǎo)的ISG15、ISG56、OAS2和BST-2等抗病毒因子，推測(cè)這些因子是ATP1B1抗HBV的主要下游因子。綜上所述，ATP1B1在不影響肝細(xì)胞增殖的情況下，可能是通過誘導(dǎo)Ⅰ型IFN（IFNα、IFNβ），上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)ISG15、ISG56、BST-2和OAS2等ISG，利用不同機(jī)制抑制HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，本實(shí)驗(yàn)為尋找抗HBV的新治療靶點(diǎn)和方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。