徐艷玲,李昊堃,王藝博,夏青娟,岳立廣,劉令九
長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司,吉林長(zhǎng)春130012
甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)引起的一種急性自限性疾病,主要經(jīng)糞-口途徑傳播,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1],其發(fā)病率與社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活水平和環(huán)境衛(wèi)生情況密切相關(guān)[2-3]。目前,甲型肝炎在全球部分地區(qū)仍有暴發(fā)[4-5],接種甲型肝炎疫苗是預(yù)防和控制該病的有效措施[6]。近年,隨著疫苗接種率的提高,我國(guó)甲型肝炎發(fā)病率呈逐年遞減趨勢(shì),流行特征呈地區(qū)性分布[7],但局部暴發(fā)時(shí)有發(fā)生。
HAV基因組是一條長(zhǎng)約7 500 bp的單鏈線性正股RNA,分為5′端非編碼區(qū)、開(kāi)放性讀碼框(open reading frame,ORF)和含有Poly(A)尾的3′端UTR。HAV ORF較長(zhǎng),可編碼1個(gè)2 227個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白,該多聚蛋白可分為P1、P2和P3區(qū)。其中P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白,包括VP4(1A)、VP2(1B)、VP3(1C)、VP1(1D);P2和P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,包括2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。HAV的衣殼蛋白由VP1~VP4組成,其中VP1、VP2、VP3是構(gòu)成病毒衣殼蛋白的主要部分。研究表明,HAV的抗原性與病毒蛋白的立體結(jié)構(gòu)有關(guān),VP3和VP1在衣殼上的天然構(gòu)象形成單個(gè)抗原表位,可誘發(fā)中和抗體反應(yīng)[8-9]。目前,國(guó)內(nèi)凍干甲型肝炎減毒活疫苗使用的毒株為L(zhǎng)-A-1和H2減毒株,這兩種病毒株生產(chǎn)的疫苗均具有良好的安全性和免疫原性[10]。疫苗生產(chǎn)過(guò)程中,毒株傳代的穩(wěn)定性與疫苗質(zhì)量密切相關(guān),因此,本研究對(duì)甲型肝炎病毒L-A-1株在人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株(簡(jiǎn)稱(chēng)2BS細(xì)胞)上連續(xù)傳代的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià),為疫苗的質(zhì)量控制及滅活疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 細(xì)胞及病毒株 2BS細(xì)胞和HAVL-A-1株(23代)由長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室提供。
1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基購(gòu)自日本日水制藥株式會(huì)社;新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;定性甲肝抗原(hepatitis A antigen,HAAg)診斷試劑盒和HAV抗體診斷試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司;病毒基因組RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DNA marker DL2000和One Step RNA PCR kit(AMV)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠,雌雄各半,體重14~16 g,購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為:SCXK(京)2014-0004。
1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出2BS細(xì)胞,37℃水浴中復(fù)蘇,用10 mL含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液按1∶2的比例傳代,37℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶4的比例傳代培養(yǎng)至31代。
1.5 病毒培養(yǎng)及傳代 將第23代HAV L-A-1株采用混懸感染的方式,按MOI=0.2接種至31代2BS細(xì)胞,35℃培養(yǎng)7 d;更換含2%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液,于接種后21 d收獲病毒液,-60℃以下凍存。按該方法連續(xù)傳10代,取第23、24、26、28和32代病毒(分別命名為L(zhǎng)-A-1-23、L-A-1-24、L-A-1-26、L-A-1-28、L-A-1-32),采用HAAg診斷試劑盒檢測(cè)病毒抗原含量,Reed-Muench法[11]計(jì)算病毒滴度。
1.6 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的HAV減毒株基因序列(AF314208),應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)7對(duì)引物,各擴(kuò)增片段大小約1 000 bp,片段間約有200 bp重疊,并用Oligo 7.0軟件驗(yàn)證引物。引物序列見(jiàn)表1,由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。
表1 HAV L-A-1株基因組擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Primer sequences for amplification of genome of L-A-1 strain
1.7 基因序列分析 用病毒基因組RNA提取試劑盒提取5代病毒基因組RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板,HAV1~HAV7為引物,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃30 s,45~60℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,共30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。采用DNAMAN軟件對(duì)病毒基因序列片段進(jìn)行拼接,得到全基因組核苷酸序列,并對(duì)不同代次病毒的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行多序列對(duì)比分析;將L-A-1-32代次病毒與GenBank中登錄的國(guó)內(nèi)外其他主要HAV毒株核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析,并比較分析L-A-1-32代次病毒與國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株的VP1和VP3蛋白的氨基酸序列,國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株的相關(guān)信息見(jiàn)表2。
表2 國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株的相關(guān)信息Tab.2 Data on major HAV strains at home and abroad
1.8 HA V L-A-1株免疫原性的檢測(cè) 取L-A-1-23、L-A-1-24、L-A-1-26、L-A-1-28、L-A-1-32代 次 病 毒收獲液,4 058×g離心15 min,棄上清,用5 mLHank′s液收集沉淀,混勻,加入5 mL三氯甲烷,振蕩30 min;4 058×g離心30 min,取上清。重復(fù)操作1次,將兩次的上清液混合,即為病毒純化液。將ICR小鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)-A-1-23組、L-A-1-24組、L-A-1-26組、L-A-1-28組、L-A-1-32組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組10只。試驗(yàn)組分別經(jīng)小鼠腹腔免疫各代次病毒純化液,陰性對(duì)照組免疫生理鹽水,均0.5 mL/只;空白對(duì)照組小鼠不免疫。免疫后28 d經(jīng)心臟采血,分離血清,采用HAV抗體診斷試劑盒檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSSStatistics 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,免疫原性檢測(cè)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 HA V L-A-1株病毒抗原含量及病毒滴度 各代次HAV L-A-1株病毒在2BS細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng),抗原含量在10 240~20 480 EU/mL之間,病毒滴度為7.00~7.50 lgCCID50/mL,見(jiàn)表3。表明HAV L-A-1株在2BS細(xì)胞上傳代穩(wěn)定性較好。
表3 各代次HAV L-A-1株病毒抗原含量及病毒滴度Tab.3 Antigen contents and virus titers of HAV L-A-1 strain of various passages
2.2 HA V L-A-1株基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 各代次HAV L-A-1株病毒基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,均可見(jiàn)約1 000 bp的HAV1~HAV7目的基因片段,大小均與預(yù)期相符,L-A-1-23代次病毒結(jié)果見(jiàn)圖1(其他代次結(jié)果略)。
圖1 HAV L-A-1-23代次病毒各基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of HAV L-A-1 strain of passage 23
2.3 各代次HA V L-A-1株基因組核苷酸及氨基酸序列的同源性 各代次HAV L-A-1株基因組序列全長(zhǎng)均為7 420 bp,5′UTR的核苷酸為1~736 bp,ORF以737 nt處的ATG為起始密碼子,編碼2 225個(gè)氨基酸,包括862個(gè)疏水性氨基酸、790個(gè)親水性氨基酸、278個(gè)堿性氨基酸、248個(gè)酸性氨基酸及較短的3′UTR區(qū)。各代次HAV L-A-1株間核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%。
2.4 HA V L-A-1株與國(guó)內(nèi)外主要HA V毒株核苷酸及氨基酸序列的同源性 國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分別達(dá)91%和98%以上。L-A-1-32代次毒株與國(guó)內(nèi)外其他主要HAV毒株核苷酸序列同源性為91.40%~99.70%,氨基酸序列同源性為98.20%~99.69%;與L-A-1參考株(AF314208)比較,核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分別為99.70%和99.69%;與MBB、LV8和H2K25株核苷酸序列同源性分別為98.84%、94.74%和98.13%,與H2W株核苷酸序列同源性最低,為91.40%;與H2K25株氨基酸序列同源性最高,為99.69%,與GBM和H2W株氨基酸序列同源性最低,為98.20%。見(jiàn)表4和表5。
表4 L-A-1-32代次病毒與國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株核苷酸序列的同源性(%)Tab.4 Homologies of nucleotide sequences of L-A-1 strain of passage 32 to those of major virus strains at home and abroad(%)
表5 L-A-1-32代次病毒與國(guó)內(nèi)外主要病毒株氨基酸的同源性(%)Tab.5 Homologies of amino acids of L-A-1 strain of passage 32 to those of major virus strains at home and abroad(%)
2.5 HA V L-A-1株與國(guó)內(nèi)外主要HA V病毒株VP1區(qū)氨基酸序列比對(duì) 各毒株間有5處氨基酸序列不一致。其中,有2處發(fā)生在GBM株及H2W株VP1的第28及296位氨基酸,均由K變?yōu)镽;LV8株VP1的第17位氨基酸由V變?yōu)镈;MBB株VP1的第147位氨基酸由T變?yōu)镮;HM175減毒株和LV8株VP1的第272位氨基酸由E變?yōu)閂。L-A-1-32代次病毒與參考株(AF314208)和H2K25減毒株VP1區(qū)氨基酸序列完全一致,表明HAV L-A-1株VP1蛋白具有良好的遺傳穩(wěn)定性,見(jiàn)圖2。
圖2 HAV L-A-1株與國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株VP1區(qū)的氨基酸序列Fig.2 Comparison of VP1 amino acid sequences in VP1 region of L-A-1 with those of major virus strains at home and abroad
2.6 HA V L-A-1株與國(guó)內(nèi)外主要HA V毒株VP3區(qū)氨基酸序列比對(duì) 各毒株VP3間有2處氨基酸序列不一致,H2W株VP3的第32位氨基酸由Q變?yōu)镻;H2W株和GBM株的第144位氨基酸由S變?yōu)門(mén);L-A-1-32代次病毒與參考株(AF314208)和H2K25減毒株VP3區(qū)氨基酸序列完全一致,見(jiàn)圖3。表明HAV L-A-1株VP3蛋白具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
圖3 HAV L-A-1株與國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株VP3區(qū)的氨基酸序列Fig.3 Comparison of VP1 amino acid sequences in VP3 region of L-A-1 with those of major virus strains at home and abroad
2.7 HA V L-A-1株的免疫原性 L-A-1-23組、L-A-1-24組、L-A-1-26組、L-A-1-28組、L-A-1-32組免疫后小鼠血清抗體效價(jià)分別為(684.69±5.95)、(750.93±14.47)、(997.84±2.60)、(854.16±15.60)、(850.11±6.20)m IU/mL,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.491,P>0.05),陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%,陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠血清抗體檢測(cè)均為陰性。
HAV L-A-1株的傳代穩(wěn)定性在疫苗質(zhì)量控制中具有重要意義。本研究將HAV L-A-1株在2BS細(xì)胞上連續(xù)傳代至32代,采用RT-PCR法對(duì)不同代次病毒全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示,HAV L-A-1株23、24、26、28和32代次病毒間核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%;病毒滴度均在7.00 lgCCID50/mL以上,符合《中國(guó)藥典》三部(2015版)[12]相關(guān)要求,且抗原含量相對(duì)比較穩(wěn)定。表明HAV L-A-1株在傳代過(guò)程中保持了良好的抗原性和感染性,且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
將L-A-1-32代次病毒與GenBank中登錄的目前國(guó)內(nèi)外主要HAV毒株進(jìn)行基因序列比對(duì),結(jié)果表明,國(guó)內(nèi)外主要的HAV毒株氨基酸序列同源性達(dá)98%以上,L-A-1-32代次病毒與L-A-1株參考株(AF314208)核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.70%和99.69,與MBB和H2K25核苷酸序列同源性分別為98.84%和98.13%,與H2W株核苷酸序列同源性最低,為91.40%;L-A-1-32代次病毒與H2K25株氨基酸序列同源性最高,為99.69%,與GBM和H2W株氨基酸序列同源性最低,為98.20%。表明國(guó)內(nèi)外主要的HAV株間氨基酸序列同源性較高。
HAV只有一個(gè)血清型,其基因組VP1和VP3區(qū)是主要的抗原區(qū)域,本研究進(jìn)一步對(duì)HAV L-A-1株與國(guó)內(nèi)外主要HAV株基因組VP1和VP3蛋白區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行分析比較,結(jié)果表明,在VP1區(qū)HAV L-A-1株與各病毒株之間有5處氨基酸序列不一致,其中2處發(fā)生在GBM和H2W株,LV8株、MBB株和HM175減毒株和LV8株各1處;在VP3區(qū)各病毒株間有2處氨基酸序列不一致,L-A-1-32代次病毒與參考株(AF314208)和H2K25株VP1和VP3區(qū)氨基酸序列完全一致。表明國(guó)內(nèi)使用的甲型肝炎減毒活疫苗株的主要抗原位點(diǎn)氨基酸序列保守,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[9,13-15]一致,且VP1和VP3區(qū)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性極少由于細(xì)胞株更改而發(fā)生變異。
為進(jìn)一步評(píng)價(jià)HAV L-A-1株不同代次的免疫原性,用L-A-1株23、24、26、28和32代次病毒液的純化產(chǎn)物免疫小鼠,結(jié)果表明,均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體,陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100%,表明不同代次L-A-1株病毒具有良好的免疫原性。綜上所述,HAV L-A-1株在2BS細(xì)胞連續(xù)傳代后,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究為疫苗的質(zhì)量控制及滅活疫苗的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。