梁愛梅，蔣士龍，李德海，包怡紅，劉浩帆

(1.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，北京 100015；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

0 引言

近些年大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，食用菌多糖具有多種生物活性[1-2]，其中木耳多糖在預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生、降血脂、抗凝血、抗氧化、防輻射、抗炎等[3-4]方面具有顯著的效果。因此，木耳多糖的研究在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中越來越受到重視。

黑木耳(Auriculariaauricula)，由菌絲體和子實(shí)體構(gòu)成，在真菌分類學(xué)中，錄屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[5]。黑木耳的細(xì)胞壁質(zhì)地堅(jiān)韌，胞壁內(nèi)多糖等活性物質(zhì)不容易從中溶出，導(dǎo)致傳統(tǒng)水提法制備黑木耳多糖生產(chǎn)周期長(zhǎng)、提取效率較低。通過使用一些現(xiàn)代物理技術(shù)可以對(duì)黑木耳進(jìn)行破壁處理，可以加速多糖等成分的釋放提高生產(chǎn)效率。研究發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)技術(shù)破壁率高、可控制、產(chǎn)熱量低以及破壁速度快等特點(diǎn)[6-7]，有利于黑木耳多糖迅速完全溶出，縮短制備時(shí)間。

以黑木耳為原料，研究高壓均質(zhì)技術(shù)對(duì)黑木耳多糖制備率的影響，采用單因素試驗(yàn)重點(diǎn)考察料液比、均質(zhì)時(shí)間、均質(zhì)壓力等因素對(duì)黑木耳多糖得率的影響，并進(jìn)一步通過響應(yīng)面Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化高壓均質(zhì)技術(shù)制備黑木耳多糖的最優(yōu)工藝。通過研究為黑木耳多糖的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳，2019年5月黑龍江省海林林業(yè)局提供，將干黑木耳粉碎后過40目篩，至于常溫下保存?zhèn)溆?；其他試劑均為分析純?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

SRH60-70型高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；FJ-200型高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器公司；R-205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝儀器公司；DL-6M型離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；LT502型電子天平，常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；722型可見分光光度計(jì)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高壓均質(zhì)技術(shù)制備黑木耳多糖的工藝研究。將一定量黑木耳原料粉采用食品級(jí)石油醚進(jìn)行脫脂處理，然后采用95%乙醇處理去除去小分子量糖，將脫脂后的黑木粉按一定料液比(1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140 g/mL)加入蒸餾水，采用高壓均質(zhì)機(jī)在一定壓力(15、20、25、30、35 MPa)下均質(zhì)處理一定時(shí)間(10、15、20、25、30、35 min)，取出黑木粉水提液以4500 r/min離心15 min后收集上層清夜，殘?jiān)鼜?fù)提，然后合并復(fù)提上清液，在65 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原初始體積的1/4，加入無水乙醇調(diào)至濃度為80%，放置于4 ℃醇沉過夜，以4 500 r/min離心10 min收集沉淀為黑木耳粗多糖，最后采用苯酚-硫酸法測(cè)定黑木耳多糖得率。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，以黑木耳多糖得率Y(%)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定均質(zhì)壓力(A)、均質(zhì)時(shí)間(B)和料液比(C)對(duì)高壓均質(zhì)方法制備黑木耳多糖的工藝的影響。

1.3.2 黑木耳多糖得率的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法[8]，配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液并置于25 mL具塞比色管中，加入6%溶解的苯酚溶液1 mL，加入5 mL濃硫酸，振搖并混合，使其在室溫下靜置30 min，采用可見分光光度計(jì)于OD490nm處測(cè)定光密度，建立葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光光度值的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將黑木耳多糖稀釋至合適濃度，以使其測(cè)量范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，在試管中精確稱取多糖稀釋液1 mL，加入1 mL水后加入6%苯酚溶液1 mL，迅速搖勻，加入5 mL濃硫酸，室溫靜置30 min后，在490 nm測(cè)量吸光度，重復(fù)3次操作，樣品中的總糖含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，最后計(jì)算出黑木耳多糖得率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做3組平行，取平均值(means±SD)，結(jié)果采用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖，采用Design Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 均質(zhì)壓力對(duì)黑木耳多糖得率的影響

從圖1結(jié)果可以看出，均質(zhì)壓力小于25 MPa時(shí)，隨著均質(zhì)壓力的增加黑木耳多糖得率提高，當(dāng)壓力為25 MPa時(shí)黑木耳多糖得率最高，隨著均質(zhì)壓力繼續(xù)增加時(shí)黑木多糖得率反而下降。其原因是適當(dāng)?shù)木|(zhì)壓力可以破碎組織壁或細(xì)胞壁，同時(shí)有利增加溶劑的溶解能力，從而提高多糖得率，但是均質(zhì)壓力過大會(huì)對(duì)導(dǎo)致溶液黏度增加不利于提取，也可能會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖得率降低[9]。因此選擇均質(zhì)壓力25 MPa為最佳點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 均質(zhì)壓力對(duì)提取率的影響

2.2 均質(zhì)時(shí)間對(duì)黑木耳多糖得率的影響

從圖2結(jié)果可以看出，黑木耳多糖得率隨著均質(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先提高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)均質(zhì)時(shí)間為25 min時(shí)，黑木耳多糖得率最高，值為33.0%。在較低均質(zhì)時(shí)間范圍內(nèi)，黑木耳多糖隨著壓力時(shí)間的延長(zhǎng)溶出量逐漸增加，但是均質(zhì)時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致多糖降解，而降低多糖得率[10]。因此選擇均質(zhì)時(shí)間25 min較為合適。

圖2 均質(zhì)時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.3 料液比對(duì)黑木耳多糖得率的影響

從圖3結(jié)果可以看出，黑木耳多糖得率隨著料液比增加呈現(xiàn)出先提高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為1∶80(g∶mL)時(shí)，黑木耳多糖得率最高，值為32.9%。其原因是液料比越大，黑木耳原料在溶劑中分散越均勻，黑木耳與溶劑接觸越充分，多糖就越容易溶出，提高多糖得率。但是當(dāng)液料比非常大時(shí)，黑木耳原料濃度顯著下降，高壓均質(zhì)對(duì)黑木耳原料組織壁破壞能力下降，導(dǎo)致多糖溶出效果不好，而降低多糖得率[11]，同時(shí)溶劑過多還會(huì)增加后期濃縮時(shí)間，增加成本。因此選擇1∶80(g∶mL)的液料比較為合適。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

2.4 黑木耳多糖制備工藝條件的優(yōu)化

2.4.1 模型方程建立與方差分析。以均質(zhì)壓力(A)、均質(zhì)時(shí)間(B)和料液比(C)為影響因素，以黑木耳多糖得率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行研究，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，采用Design-Expert軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，得到響應(yīng)面回歸方程為Y=40.60-0.43A+0.10B-1.31C-0.45A×B+0.09A×C+1.57B×C-3.23A2-4.57B2-3.50C2。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)方案及結(jié)果

從表2中可以看出，模型p<0.0001，表明回歸模型對(duì)黑木耳多糖提取率的響應(yīng)值表現(xiàn)出極顯著水平，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1378>0.05)，表明該回歸模型計(jì)算結(jié)果與檢驗(yàn)結(jié)果的差異性不顯著。模型決定系數(shù)R2=0.9937，變化系數(shù)CV=1.29，說明試驗(yàn)預(yù)測(cè)值和實(shí)際值顯著相關(guān)，模型擬合較好，可以用于響應(yīng)值的預(yù)測(cè)。從表2中方差分析結(jié)果中還可以看出，回歸模型二次項(xiàng)中的C、BC、A2、B2、C2對(duì)黑木耳多糖得率有極顯著影響(P<0.01)，A達(dá)到顯著水平，AB與AC不顯著(P>0.05)。從F值可知，三個(gè)因素對(duì)黑木耳多糖得率的影響大小順序?yàn)椋毫弦罕?C)>均質(zhì)壓力(A)>均質(zhì)時(shí)間(B)。

表2 回歸模型方差分析

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析。Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面圖和等高線圖能夠直觀看出制備因素兩兩之間的交互作用，曲面越平緩等高線越稀疏表明對(duì)成分提取率影響越小；而曲面越陡峭等高線越密集表明對(duì)成分提取率影響越顯著[12]。因此將回歸模型中的某個(gè)因素看成零水平，就能夠知道其他兩個(gè)變量的相互作用結(jié)果。由圖4、圖5和圖6響應(yīng)面和等高線圖中可以看出，料液比(C)的響應(yīng)面最為陡峭，說明料液比(C)對(duì)高壓均質(zhì)法制備黑木耳多糖影響最為顯著，其次是均質(zhì)壓力(A)與均質(zhì)時(shí)間(B)，此結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖4 均質(zhì)壓力和均質(zhì)時(shí)間交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 均質(zhì)壓力和料液比交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 均質(zhì)時(shí)間和料液比交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.4.3 提取工藝條件的優(yōu)化和可靠性驗(yàn)證。通過響應(yīng)面軟件得到最佳提取工藝為：均質(zhì)時(shí)間24.91 min，均質(zhì)壓力24.66 MPa，料液比1∶76.15，黑木耳多糖得率理論值可達(dá)40.74%?？紤]到實(shí)際操作的方便，將最佳工藝條件調(diào)整為：均質(zhì)時(shí)間25 min，均質(zhì)壓力25 MPa，料液比1∶76，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，黑木耳多糖得率為(40.33±0.41)%。可見，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值非常接近，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)高壓均質(zhì)法提取黑木耳多糖的得率。

3 結(jié)論

采用高壓均質(zhì)技術(shù)提取了黑木耳多糖，并利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為均質(zhì)時(shí)間25 min，均質(zhì)壓力25 MPa，料液比1∶76，在此工藝下黑木耳多糖得率可達(dá)(40.33±0.41)%。高壓均質(zhì)技術(shù)能夠充分破碎黑木耳組織結(jié)構(gòu)，使可溶性多糖最大限度的溶出，與傳統(tǒng)工藝相比具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，提取率高等優(yōu)點(diǎn)，為多糖的提取提供了一條新型綠色的新途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。