張潤嬌 董莉 劉芃芃 張蕊 韓雷 程亞楠 于津浦

作者單位：天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤分子診斷中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室（天津市300060）

甲狀腺結(jié)節(jié)是頭頸部最常見的疾病，其中5%～15%的甲狀腺結(jié)節(jié)為惡性。近年來，甲狀腺癌的患病率不斷上升，數(shù)據(jù)顯示全球范圍內(nèi)女性甲狀腺癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中占第7 位[1-2]，中國女性惡性腫瘤中甲狀腺癌的發(fā)病率占第4 位[3]。甲狀腺癌起源于甲狀腺濾泡上皮細胞或濾泡旁細胞，其病理類型包括分化型甲狀腺癌、未分化型甲狀腺癌和甲狀腺髓樣癌，其中分化型甲狀腺癌中的甲狀腺乳頭狀癌最為常見（70%～80%）[4]。

良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的臨床處理方式差別較大。因此，甲狀腺結(jié)節(jié)的評估要點主要是良惡性的鑒別。甲狀腺癌是一類多基因變異的疾病，常見變異類型為基因突變和融合。近年來，隨著二代測序技術(shù)的普及，甲狀腺癌的基因變異譜研究受到越來越多的關(guān)注。有研究表明，甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)患者的臨床病理特征并不一致，且針對甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)基因變異的研究也越來越多，但是針對兩者之間多基因變異差異的組學研究相對較少[5-8]。本研究通過二代測序?qū)?87 例甲狀腺結(jié)節(jié)和81例癌旁正常甲狀腺組織進行基因變異差異的分析，進一步為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別尋找有效的分子標志物。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選擇2014年12月至2018年5月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院甲狀腺癌患者187 例，其中男性46 例，女性141例，年齡21～72 歲，平均年齡45.47 歲。另選取同期81例癌旁正常甲狀腺組織。樣本來自甲狀腺細針穿刺手術(shù)過程中取樣或甲狀腺腺葉切除術(shù)術(shù)中取樣。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺細針穿刺活檢 患者取仰臥位，墊肩，頸部過伸，充分暴露頸前區(qū)，超聲引導應用高頻線陣探頭，頻率12 MHz，對甲狀腺進行常規(guī)檢查，并消毒頸前區(qū)，2%利多卡因?qū)κ中g(shù)部位進行局部麻醉，穿刺針（23 G×8 cm）于超聲定位點進針，到達病灶區(qū)，吸出組織液注于組織固定液（4%多聚甲醛）內(nèi)，送檢細胞學及基因測序。

1.2.2 組織DNA 和RNA 提取 利用DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）和RNA 提取試劑盒從組織固定液中的組織中分別提取DNA 和RNA，應用NanoDrop One 微量核酸蛋白濃度測定儀檢測雙鏈DNA 和RNA 的濃度，保證DNA/RNA 的吸光度比值（A260/A280）為1.8～2.0。

1.2.3 高通量測序 組織樣本中提取到的RNA 通過RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將在組織樣本中提取的DNA 樣本和逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 樣本進行基因組定量后，通過磁珠篩選再用捕獲探針雜交，將最終篩選出的雜交體通過PCR 進行擴增，上機測序并進一步進行文庫構(gòu)建。測序在Illumina MiSeq 平臺上進行，平均測序深度為2 811×?；驒z測Panel 對突變的檢測包括MUC12、AKT1、ANKRD36、APC、ATM、BRAF、BRCA1、C18orf10、CDC27、CHEK2、COMP、CTNNB1、EGFR、EIF1AX、FRG1、FRG2C、GGT1、GNAS、HLA-A、HRAS、IDH1、IGSF3、KIAA0430、KRAS、KRTAP4-8、KRTAP9-1、MLL、MLL3、MUC6、NEFH、NRAS、OBSL1、OTOP1、OTUD4、PIK3CA、POTED、PRAMEF2、PTEN、RET、SYVN1、TAS2R31、TERT、TP53、TSHR、ZNF717、EZH1、SPOP、ZNF148 共48 個基因；融合檢測包括BRAF、NTRK1、NTRK3、ALK、PPARG、THADA、MAML2 和RET 共8 個基因，涵蓋CCDC6-RET（3）、GOLGA5-RET、ETV6-NTRK3（2）、HOOK3-RET、KTN1-RET、ERC1-RET、NCOA4-RET（4）、AKAP9-BRAF、PAX8-PPARG（4）、PCM1-RET、TGF-NTRK1（2）和TPM3-NTRK1 等36種融合類型。

1.2.4 基因變異檢測結(jié)果分析 采用FASTQC 和Trimmomatic 軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行評估。使用BWA-MEM 軟件包，將測序數(shù)據(jù)回帖至人類參考基因組（GRCh37/hg19）。將Fastq 文件使用Sentieon（https://support.sentieon.com/manual/）和Starfusion 軟件（https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion/wiki）分別得到SNP Indel 和融合的位點結(jié)果。其中SNP Indel 的vcf 結(jié)果基于2019 版Annovar 工具及注釋庫（https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）注釋相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息（包括ClinVar、COSMIC、dbnsfp、dbscsnv、dbsnp、esp6500、exac、g1000、gnomad、HGMD、ICGC 和refGene 等），獲得SNP Indel注釋結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

在基于目標區(qū)域富集的二代測序的甲狀腺結(jié)節(jié)基因變異檢測中，所有測序數(shù)據(jù)的Q30 均>87%，目標區(qū)域測序深度范圍為165～7 104×，平均測序深度為2 811×。測序讀段的長度分布在120～150 bp。平均98.1%的測序讀段可以比對至基因組。提示探針捕獲效率具有較好的可重復性，測序數(shù)據(jù)的可靠性高。

2.2 突變檢出情況

本研究共檢測出突變476 個，累計突變基因40 個，包括錯義突變、框移突變、插入/缺失突變和無義突變。突變基因分為驅(qū)動基因和非驅(qū)動基因兩大類，驅(qū)動基因又分為功能獲得型驅(qū)動基因（BRAF、RET、CTNNB1、IDH1、NRAS、HRAS、KRAS、AKT1、PIK-3CA、TERT、GNAS）和功能缺失型驅(qū)動基因（TP53、PTEN、CDC27、APC、ZNF717）；非驅(qū)動基因包括DNA 損傷修復基因（CHEK2、ATM、BRCA1、OTUD4），免疫相關(guān)基因（HLA-A、MUC6、IGSF3），染色體重塑相關(guān)基因（KMT2C、PRAMEF2、NEFH、KMT2A），膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因（TAS2R31、OBSL1、SYVN1、MUC-3A），激素相關(guān)基因（TSHR），代謝相關(guān)基因（OTOP1、GGT1），角蛋白相關(guān)基因（KRTAP9-1、KRTAP4-8），錨蛋白相關(guān)基因（POTED、ANKRD36）和其他基因（FRG2C、TPGS2），見圖1。

圖1 癌組織、可疑良性結(jié)節(jié)與正常組織3 組的基因突變占比

根據(jù)細胞學或病理學結(jié)果，187 例甲狀腺結(jié)節(jié)樣本分為甲狀腺癌129 例（乳頭狀癌124 例、髓樣癌4 例、肉瘤樣癌1例）和可疑良性結(jié)節(jié)58 例。甲狀腺癌樣本的突變基因37 個，可疑良性結(jié)節(jié)的突變基因35 個。對癌組織、可疑良性結(jié)節(jié)與正常組織3 組的基因變異整體分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)發(fā)生突變的基因較多，且各基因的突變位點也較多。其中，驅(qū)動基因（BRAF、RET、PIK3CA、HRAS、TERT、APC、PTEN、ZNF717）、DNA 損傷修復基因（ATM、CHEK2、OTUD4）、免疫相關(guān)基因（HLA-A、IGSF3）、染色體重塑相關(guān)基因（KMT2C、PRAMEF2）等在癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)中突變占比均顯著高于正常組織（均P<0.05）。

2.3 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)基因變異差異分析

在癌組織中，BRAF（P<0.001）、ZNF717（P=0.031）、TERT（P=0.049）、GGT1（P=0.008）、CHEK2（P=0.014）、OTUD4（P<0.001）、RET 蛋白激酶域（P=0.047）的突變占比和基因融合的發(fā)生頻率（P=0.045）均顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)。而HRAS（P=0.134）、KRAS（P=0.103）、NRAS（P=0.182）、PIK3CA（P=0.987）、PTEN（P=0.104）和AKT1（P=0.340）等基因的突變占比在兩組間無顯著性差異。

BRAFV600E突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的突變類型，是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的重要指標。本研究在癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)中均檢測出BRAFV600E突變，其中癌組織93 例（72.09%），可疑良性結(jié)節(jié)10 例（17.24%），兩者比較有顯著性差異（P<0.001）。除BRAFV600E外，同樣檢測出BRAF 其他位點的突變，這些位點主要分布于BRAF 蛋白的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。與BRAFV600E突變不同，BRAF 非V600E 突變在癌組織中僅檢出1例（0.78%），而在可疑良性結(jié)節(jié)中檢出10 例（17.24%），且突變占比在兩組有顯著性差異（P<0.001）。

RET 蛋白激酶域突變在癌組織中突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)（P=0.047），并且在癌組織中，RET功能域突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P=0.036）。除RET 蛋白激酶域突變外，GGT1 在癌組織突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，且該基因突變同樣與甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P=0.02），見表1，2。

表1 BRAF 等突變基因與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例

2.4 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)突變通路差異分析

對突變基因涉及的相關(guān)通路進行分析發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路（P=0.053）和AMPK 通路（P=0.023）相關(guān)基因的突變占比在癌組織中顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，且在癌組織中，PI3K/Akt 通路（P=0.060）和AMPK 通路（P=0.056）的基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)趨勢（表3）。

表3 突變基因相關(guān)通路與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例（續(xù)表3）

表3 突變基因相關(guān)通路與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例

表2 OTUD4 等突變基因與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例

2.5 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)基因融合差異分析

在癌組織中，基因融合的占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)[分別為13 例（10.08%）和1例（1.72%），P=0.045]。14 例檢出的融合類型有CCDC6-RET（RET/PTC1）、NCOA4-RET（RET/PTC3）、ETV6-NTRK3 和TPM3-NTRK1，其中癌組織中檢出CCDC6-RET 2 例（1.55%），融合部位為CCDC6 第1 外顯子和RET 第12 外顯子；NCOA4-RET 檢出5 例（3.88%），融合部位為NCOA4 第8 外顯子和RET 第12 外顯子；ETV6-NTRK3 檢出5 例（3.88%），融合部位為ETV6 第4 外顯子和NTRK3 第14 外顯子；TPM3-NTRK1 檢出1例（0.78%），融合部位為TPM3 第7 外顯子和NTRK1 第10 外顯子；良性結(jié)節(jié)檢出1例的融合部位為NCOA4-RET。各檢出融合部位均與甲狀腺癌最常見的融合部位相一致。

3 討論

甲狀腺癌是一類多基因變異的疾病，在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中，驅(qū)動基因變異發(fā)揮著重要作用。有研究表明，甲狀腺癌并非起源于甲狀腺良性結(jié)節(jié)，而且甲狀腺良性結(jié)節(jié)與甲狀腺癌的突變背景不同[5-10]。本研究通過對187 例甲狀腺結(jié)節(jié)和81例癌旁正常甲狀腺組織進行二代基因測序并進行變異的差異分析發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌的基因變異特征與可疑良性結(jié)節(jié)存在明顯差異，雖然癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)在部分基因的突變占比方面差異不顯著，但是癌組織在BRAF、TERT、ZNF717、GGT1、CHEK2、OTUD4、RET、PI3K/Akt 通路相關(guān)基因的突變占比以及基因融合的發(fā)生頻率均顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，這些基因或可以輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別。與甲狀腺癌相比，甲狀腺可疑良性結(jié)節(jié)中已有驅(qū)動基因的改變（BRAF、PIK3CA、ZNF717、TERT、HRAS、KRAS、NRAS、PTEN、RET），這說明分子事件在表型改變前已經(jīng)啟動。

BRAFV600E突變是目前已知甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的重要指標[11]，本研究在可疑良性結(jié)節(jié)組檢出的10例BRAFV600E突變樣本可能并不完全為良性而更傾向于惡性，提示單純的細胞學檢查結(jié)果并不一定可以完全準確的確定樣本類型，需要同時結(jié)合二代測序來提高檢測的敏感度，從而降低漏診率。

RAS 基因的突變與腫瘤發(fā)生相關(guān)，在甲狀腺乳頭狀癌中，RAS 的突變占比為10%～20%，其中NRAS第61 密碼子和HRAS 第61 密碼子的突變最為常見[12-13]。有報道，在組織學良性的甲狀腺結(jié)節(jié)中可見HRAS、KRAS 和NRAS 突變[14-16]，而且有研究證明單純的RAS 突變并不一定能使良性的甲狀腺結(jié)節(jié)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒訹16]，此發(fā)現(xiàn)與本結(jié)果相一致，因此RAS 突變并不能夠作為區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的獨立指標。

TERT 基因編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，其最常見的突變位點為啟動子第124 位點和第146 位點C 至T 的改變（C228T 和C250T），此改變可以調(diào)控端粒酶活性，使細胞內(nèi)的端粒酶數(shù)量增多和活性增強，從而延緩細胞的凋亡過程，促進腫瘤的形成[17-19]。本研究檢測出的TERT 突變多集中于端粒酶核糖核蛋白復合物-RNA 結(jié)合域，而且突變以R488H 最為多見。該結(jié)構(gòu)域的突變可能改變端粒酶DNA 的動態(tài)，破壞DNARNA 復合物的穩(wěn)定性，從而加強端粒酶的持續(xù)合成能力[20-22]。而TERT 在癌組織中的突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，提示TERT 可以作為輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的指標。

RET 基因的激活性點突變在甲狀腺髓樣癌中最為常見，而RET 基因在甲狀腺乳頭狀癌中的突變占比則遠小于甲狀腺髓樣癌（>80%）[23]。本研究結(jié)果顯示，RET 功能域突變和RET 融合在癌組織中突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，但在正常組織中無突變；在癌組織中，RET 蛋白激酶域突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示RET 可以作為輔助甲狀腺良惡性鑒別和判斷轉(zhuǎn)移狀態(tài)的一個重要指標。

DNA 損傷修復基因CHEK2 和OTUD4 在癌組織中突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，這表明可疑良性結(jié)節(jié)中DNA 損傷修復基因未發(fā)生太多改變；而且CHEK2 和OTUD4 與ZNF717、TSHR、TERT、PIK3-CA 等基因有明顯的伴發(fā)突變現(xiàn)象，提示DNA 損傷修復缺陷與其他突變基因協(xié)同參與甲狀腺癌的形成，DNA 損傷修復基因也可能作為輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的指標。

PI3K/Akt 通路和AMPK 通路在甲狀腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮主要作用，PI3K/Akt 通路和AMPK 通路通過調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡、免疫、代謝和自噬等過程而誘導甲狀腺細胞發(fā)生癌變[24-29]，而本研究對突變基因涉及的通路與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析中也發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路和AMPK 通路相關(guān)基因的突變占比在癌組織顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，且在癌組織中，PI3K/Akt通路和AMPK 通路基因突變同樣與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)趨勢，提示此兩條信號通路不僅可用于輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別，也可以輔助甲狀腺癌的危險度預測。

此外，基因融合在甲狀腺癌組織中的發(fā)生頻率同樣顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，是輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的一個重要指標?；蛉诤峡梢允沟鞍桌野彼峒っ副磉_活性異常，從而增強其自身激酶活性，進而激活下游信號分子，使細胞增殖調(diào)節(jié)紊亂而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[30-34]。同時，本研究檢測到的基因融合均為甲狀腺癌靶向治療的重要靶點，提示基因融合不僅可用于輔助良惡性鑒別也可以指導臨床靶向藥物選擇。

通過二代測序技術(shù)，本研究在原有的BRAFV600E之外發(fā)現(xiàn)了新的分子標志物，該發(fā)現(xiàn)可以輔助甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別并為甲狀腺癌患者的臨床治療提供指導。由于經(jīng)B 超和細針穿刺活檢確定為良性結(jié)節(jié)的樣本并未進行手術(shù)切除和病理學檢測，所以不能確定這些樣本的具體組織學亞型，本研究將樣本分類為可疑良性結(jié)節(jié)組。BRAFV600E突變是目前已知甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的重要指標，在可疑良性結(jié)節(jié)組檢出的10 例BRAFV600E突變樣本可能更傾向為癌組織。此10 例病例將進行密切的跟蹤隨訪，以便觀察其結(jié)節(jié)的變化情況。而在后續(xù)的研究中，在B 超和細針穿刺活檢確定為良性結(jié)節(jié)之后，應進一步進行手術(shù)切除并通過病理學檢測確定其具體的組織學亞型。而且，本研究中的一些統(tǒng)計有邊緣效應，可能因為研究的樣本例數(shù)較少，因此需要進一步增加樣本量來提高統(tǒng)計學顯著性，并且深入探究上述基因變異對甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的影響。