張潤嬌 董莉 劉芃芃 張蕊 韓雷 程亞楠 于津浦

作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤分子診斷中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）

甲狀腺結(jié)節(jié)是頭頸部最常見的疾病，其中5%～15%的甲狀腺結(jié)節(jié)為惡性。近年來，甲狀腺癌的患病率不斷上升，數(shù)據(jù)顯示全球范圍內(nèi)女性甲狀腺癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中占第7 位[1-2]，中國女性惡性腫瘤中甲狀腺癌的發(fā)病率占第4 位[3]。甲狀腺癌起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞或?yàn)V泡旁細(xì)胞，其病理類型包括分化型甲狀腺癌、未分化型甲狀腺癌和甲狀腺髓樣癌，其中分化型甲狀腺癌中的甲狀腺乳頭狀癌最為常見（70%～80%）[4]。

良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的臨床處理方式差別較大。因此，甲狀腺結(jié)節(jié)的評估要點(diǎn)主要是良惡性的鑒別。甲狀腺癌是一類多基因變異的疾病，常見變異類型為基因突變和融合。近年來，隨著二代測序技術(shù)的普及，甲狀腺癌的基因變異譜研究受到越來越多的關(guān)注。有研究表明，甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)患者的臨床病理特征并不一致，且針對甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)基因變異的研究也越來越多，但是針對兩者之間多基因變異差異的組學(xué)研究相對較少[5-8]。本研究通過二代測序?qū)?87 例甲狀腺結(jié)節(jié)和81例癌旁正常甲狀腺組織進(jìn)行基因變異差異的分析，進(jìn)一步為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別尋找有效的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選擇2014年12月至2018年5月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院甲狀腺癌患者187 例，其中男性46 例，女性141例，年齡21～72 歲，平均年齡45.47 歲。另選取同期81例癌旁正常甲狀腺組織。樣本來自甲狀腺細(xì)針穿刺手術(shù)過程中取樣或甲狀腺腺葉切除術(shù)術(shù)中取樣。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺細(xì)針穿刺活檢 患者取仰臥位，墊肩，頸部過伸，充分暴露頸前區(qū)，超聲引導(dǎo)應(yīng)用高頻線陣探頭，頻率12 MHz，對甲狀腺進(jìn)行常規(guī)檢查，并消毒頸前區(qū)，2%利多卡因?qū)κ中g(shù)部位進(jìn)行局部麻醉，穿刺針（23 G×8 cm）于超聲定位點(diǎn)進(jìn)針，到達(dá)病灶區(qū)，吸出組織液注于組織固定液（4%多聚甲醛）內(nèi)，送檢細(xì)胞學(xué)及基因測序。

1.2.2 組織DNA 和RNA 提取 利用DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）和RNA 提取試劑盒從組織固定液中的組織中分別提取DNA 和RNA，應(yīng)用NanoDrop One 微量核酸蛋白濃度測定儀檢測雙鏈DNA 和RNA 的濃度，保證DNA/RNA 的吸光度比值（A260/A280）為1.8～2.0。

1.2.3 高通量測序 組織樣本中提取到的RNA 通過RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將在組織樣本中提取的DNA 樣本和逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 樣本進(jìn)行基因組定量后，通過磁珠篩選再用捕獲探針雜交，將最終篩選出的雜交體通過PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，上機(jī)測序并進(jìn)一步進(jìn)行文庫構(gòu)建。測序在Illumina MiSeq 平臺上進(jìn)行，平均測序深度為2 811×?；驒z測Panel 對突變的檢測包括MUC12、AKT1、ANKRD36、APC、ATM、BRAF、BRCA1、C18orf10、CDC27、CHEK2、COMP、CTNNB1、EGFR、EIF1AX、FRG1、FRG2C、GGT1、GNAS、HLA-A、HRAS、IDH1、IGSF3、KIAA0430、KRAS、KRTAP4-8、KRTAP9-1、MLL、MLL3、MUC6、NEFH、NRAS、OBSL1、OTOP1、OTUD4、PIK3CA、POTED、PRAMEF2、PTEN、RET、SYVN1、TAS2R31、TERT、TP53、TSHR、ZNF717、EZH1、SPOP、ZNF148 共48 個(gè)基因；融合檢測包括BRAF、NTRK1、NTRK3、ALK、PPARG、THADA、MAML2 和RET 共8 個(gè)基因，涵蓋CCDC6-RET（3）、GOLGA5-RET、ETV6-NTRK3（2）、HOOK3-RET、KTN1-RET、ERC1-RET、NCOA4-RET（4）、AKAP9-BRAF、PAX8-PPARG（4）、PCM1-RET、TGF-NTRK1（2）和TPM3-NTRK1 等36種融合類型。

1.2.4 基因變異檢測結(jié)果分析 采用FASTQC 和Trimmomatic 軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行評估。使用BWA-MEM 軟件包，將測序數(shù)據(jù)回帖至人類參考基因組（GRCh37/hg19）。將Fastq 文件使用Sentieon（https://support.sentieon.com/manual/）和Starfusion 軟件（https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion/wiki）分別得到SNP Indel 和融合的位點(diǎn)結(jié)果。其中SNP Indel 的vcf 結(jié)果基于2019 版Annovar 工具及注釋庫（https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）注釋相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息（包括ClinVar、COSMIC、dbnsfp、dbscsnv、dbsnp、esp6500、exac、g1000、gnomad、HGMD、ICGC 和refGene 等），獲得SNP Indel注釋結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

在基于目標(biāo)區(qū)域富集的二代測序的甲狀腺結(jié)節(jié)基因變異檢測中，所有測序數(shù)據(jù)的Q30 均>87%，目標(biāo)區(qū)域測序深度范圍為165～7 104×，平均測序深度為2 811×。測序讀段的長度分布在120～150 bp。平均98.1%的測序讀段可以比對至基因組。提示探針捕獲效率具有較好的可重復(fù)性，測序數(shù)據(jù)的可靠性高。

2.2 突變檢出情況

本研究共檢測出突變476 個(gè)，累計(jì)突變基因40 個(gè)，包括錯(cuò)義突變、框移突變、插入/缺失突變和無義突變。突變基因分為驅(qū)動基因和非驅(qū)動基因兩大類，驅(qū)動基因又分為功能獲得型驅(qū)動基因（BRAF、RET、CTNNB1、IDH1、NRAS、HRAS、KRAS、AKT1、PIK-3CA、TERT、GNAS）和功能缺失型驅(qū)動基因（TP53、PTEN、CDC27、APC、ZNF717）；非驅(qū)動基因包括DNA 損傷修復(fù)基因（CHEK2、ATM、BRCA1、OTUD4），免疫相關(guān)基因（HLA-A、MUC6、IGSF3），染色體重塑相關(guān)基因（KMT2C、PRAMEF2、NEFH、KMT2A），膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（TAS2R31、OBSL1、SYVN1、MUC-3A），激素相關(guān)基因（TSHR），代謝相關(guān)基因（OTOP1、GGT1），角蛋白相關(guān)基因（KRTAP9-1、KRTAP4-8），錨蛋白相關(guān)基因（POTED、ANKRD36）和其他基因（FRG2C、TPGS2），見圖1。

圖1 癌組織、可疑良性結(jié)節(jié)與正常組織3 組的基因突變占比

根據(jù)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)結(jié)果，187 例甲狀腺結(jié)節(jié)樣本分為甲狀腺癌129 例（乳頭狀癌124 例、髓樣癌4 例、肉瘤樣癌1例）和可疑良性結(jié)節(jié)58 例。甲狀腺癌樣本的突變基因37 個(gè)，可疑良性結(jié)節(jié)的突變基因35 個(gè)。對癌組織、可疑良性結(jié)節(jié)與正常組織3 組的基因變異整體分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)發(fā)生突變的基因較多，且各基因的突變位點(diǎn)也較多。其中，驅(qū)動基因（BRAF、RET、PIK3CA、HRAS、TERT、APC、PTEN、ZNF717）、DNA 損傷修復(fù)基因（ATM、CHEK2、OTUD4）、免疫相關(guān)基因（HLA-A、IGSF3）、染色體重塑相關(guān)基因（KMT2C、PRAMEF2）等在癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)中突變占比均顯著高于正常組織（均P<0.05）。

2.3 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)基因變異差異分析

在癌組織中，BRAF（P<0.001）、ZNF717（P=0.031）、TERT（P=0.049）、GGT1（P=0.008）、CHEK2（P=0.014）、OTUD4（P<0.001）、RET 蛋白激酶域（P=0.047）的突變占比和基因融合的發(fā)生頻率（P=0.045）均顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)。而HRAS（P=0.134）、KRAS（P=0.103）、NRAS（P=0.182）、PIK3CA（P=0.987）、PTEN（P=0.104）和AKT1（P=0.340）等基因的突變占比在兩組間無顯著性差異。

BRAFV600E突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的突變類型，是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的重要指標(biāo)。本研究在癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)中均檢測出BRAFV600E突變，其中癌組織93 例（72.09%），可疑良性結(jié)節(jié)10 例（17.24%），兩者比較有顯著性差異（P<0.001）。除BRAFV600E外，同樣檢測出BRAF 其他位點(diǎn)的突變，這些位點(diǎn)主要分布于BRAF 蛋白的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。與BRAFV600E突變不同，BRAF 非V600E 突變在癌組織中僅檢出1例（0.78%），而在可疑良性結(jié)節(jié)中檢出10 例（17.24%），且突變占比在兩組有顯著性差異（P<0.001）。

RET 蛋白激酶域突變在癌組織中突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)（P=0.047），并且在癌組織中，RET功能域突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P=0.036）。除RET 蛋白激酶域突變外，GGT1 在癌組織突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，且該基因突變同樣與甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P=0.02），見表1，2。

表1 BRAF 等突變基因與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例

2.4 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)突變通路差異分析

對突變基因涉及的相關(guān)通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路（P=0.053）和AMPK 通路（P=0.023）相關(guān)基因的突變占比在癌組織中顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，且在癌組織中，PI3K/Akt 通路（P=0.060）和AMPK 通路（P=0.056）的基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)趨勢（表3）。

表3 突變基因相關(guān)通路與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例（續(xù)表3）

表3 突變基因相關(guān)通路與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例

表2 OTUD4 等突變基因與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析 例

2.5 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)基因融合差異分析

在癌組織中，基因融合的占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)[分別為13 例（10.08%）和1例（1.72%），P=0.045]。14 例檢出的融合類型有CCDC6-RET（RET/PTC1）、NCOA4-RET（RET/PTC3）、ETV6-NTRK3 和TPM3-NTRK1，其中癌組織中檢出CCDC6-RET 2 例（1.55%），融合部位為CCDC6 第1 外顯子和RET 第12 外顯子；NCOA4-RET 檢出5 例（3.88%），融合部位為NCOA4 第8 外顯子和RET 第12 外顯子；ETV6-NTRK3 檢出5 例（3.88%），融合部位為ETV6 第4 外顯子和NTRK3 第14 外顯子；TPM3-NTRK1 檢出1例（0.78%），融合部位為TPM3 第7 外顯子和NTRK1 第10 外顯子；良性結(jié)節(jié)檢出1例的融合部位為NCOA4-RET。各檢出融合部位均與甲狀腺癌最常見的融合部位相一致。

3 討論

甲狀腺癌是一類多基因變異的疾病，在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中，驅(qū)動基因變異發(fā)揮著重要作用。有研究表明，甲狀腺癌并非起源于甲狀腺良性結(jié)節(jié)，而且甲狀腺良性結(jié)節(jié)與甲狀腺癌的突變背景不同[5-10]。本研究通過對187 例甲狀腺結(jié)節(jié)和81例癌旁正常甲狀腺組織進(jìn)行二代基因測序并進(jìn)行變異的差異分析發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌的基因變異特征與可疑良性結(jié)節(jié)存在明顯差異，雖然癌組織和可疑良性結(jié)節(jié)在部分基因的突變占比方面差異不顯著，但是癌組織在BRAF、TERT、ZNF717、GGT1、CHEK2、OTUD4、RET、PI3K/Akt 通路相關(guān)基因的突變占比以及基因融合的發(fā)生頻率均顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，這些基因或可以輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別。與甲狀腺癌相比，甲狀腺可疑良性結(jié)節(jié)中已有驅(qū)動基因的改變（BRAF、PIK3CA、ZNF717、TERT、HRAS、KRAS、NRAS、PTEN、RET），這說明分子事件在表型改變前已經(jīng)啟動。

BRAFV600E突變是目前已知甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的重要指標(biāo)[11]，本研究在可疑良性結(jié)節(jié)組檢出的10例BRAFV600E突變樣本可能并不完全為良性而更傾向于惡性，提示單純的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果并不一定可以完全準(zhǔn)確的確定樣本類型，需要同時(shí)結(jié)合二代測序來提高檢測的敏感度，從而降低漏診率。

RAS 基因的突變與腫瘤發(fā)生相關(guān)，在甲狀腺乳頭狀癌中，RAS 的突變占比為10%～20%，其中NRAS第61 密碼子和HRAS 第61 密碼子的突變最為常見[12-13]。有報(bào)道，在組織學(xué)良性的甲狀腺結(jié)節(jié)中可見HRAS、KRAS 和NRAS 突變[14-16]，而且有研究證明單純的RAS 突變并不一定能使良性的甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒訹16]，此發(fā)現(xiàn)與本結(jié)果相一致，因此RAS 突變并不能夠作為區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的獨(dú)立指標(biāo)。

TERT 基因編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，其最常見的突變位點(diǎn)為啟動子第124 位點(diǎn)和第146 位點(diǎn)C 至T 的改變（C228T 和C250T），此改變可以調(diào)控端粒酶活性，使細(xì)胞內(nèi)的端粒酶數(shù)量增多和活性增強(qiáng)，從而延緩細(xì)胞的凋亡過程，促進(jìn)腫瘤的形成[17-19]。本研究檢測出的TERT 突變多集中于端粒酶核糖核蛋白復(fù)合物-RNA 結(jié)合域，而且突變以R488H 最為多見。該結(jié)構(gòu)域的突變可能改變端粒酶DNA 的動態(tài)，破壞DNARNA 復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而加強(qiáng)端粒酶的持續(xù)合成能力[20-22]。而TERT 在癌組織中的突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，提示TERT 可以作為輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的指標(biāo)。

RET 基因的激活性點(diǎn)突變在甲狀腺髓樣癌中最為常見，而RET 基因在甲狀腺乳頭狀癌中的突變占比則遠(yuǎn)小于甲狀腺髓樣癌（>80%）[23]。本研究結(jié)果顯示，RET 功能域突變和RET 融合在癌組織中突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，但在正常組織中無突變；在癌組織中，RET 蛋白激酶域突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示RET 可以作為輔助甲狀腺良惡性鑒別和判斷轉(zhuǎn)移狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。

DNA 損傷修復(fù)基因CHEK2 和OTUD4 在癌組織中突變占比顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，這表明可疑良性結(jié)節(jié)中DNA 損傷修復(fù)基因未發(fā)生太多改變；而且CHEK2 和OTUD4 與ZNF717、TSHR、TERT、PIK3-CA 等基因有明顯的伴發(fā)突變現(xiàn)象，提示DNA 損傷修復(fù)缺陷與其他突變基因協(xié)同參與甲狀腺癌的形成，DNA 損傷修復(fù)基因也可能作為輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的指標(biāo)。

PI3K/Akt 通路和AMPK 通路在甲狀腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮主要作用，PI3K/Akt 通路和AMPK 通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、免疫、代謝和自噬等過程而誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞發(fā)生癌變[24-29]，而本研究對突變基因涉及的通路與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析中也發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路和AMPK 通路相關(guān)基因的突變占比在癌組織顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，且在癌組織中，PI3K/Akt通路和AMPK 通路基因突變同樣與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)趨勢，提示此兩條信號通路不僅可用于輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別，也可以輔助甲狀腺癌的危險(xiǎn)度預(yù)測。

此外，基因融合在甲狀腺癌組織中的發(fā)生頻率同樣顯著高于可疑良性結(jié)節(jié)，是輔助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的一個(gè)重要指標(biāo)?；蛉诤峡梢允沟鞍桌野彼峒っ副磉_(dá)活性異常，從而增強(qiáng)其自身激酶活性，進(jìn)而激活下游信號分子，使細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)紊亂而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[30-34]。同時(shí)，本研究檢測到的基因融合均為甲狀腺癌靶向治療的重要靶點(diǎn)，提示基因融合不僅可用于輔助良惡性鑒別也可以指導(dǎo)臨床靶向藥物選擇。

通過二代測序技術(shù)，本研究在原有的BRAFV600E之外發(fā)現(xiàn)了新的分子標(biāo)志物，該發(fā)現(xiàn)可以輔助甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別并為甲狀腺癌患者的臨床治療提供指導(dǎo)。由于經(jīng)B 超和細(xì)針穿刺活檢確定為良性結(jié)節(jié)的樣本并未進(jìn)行手術(shù)切除和病理學(xué)檢測，所以不能確定這些樣本的具體組織學(xué)亞型，本研究將樣本分類為可疑良性結(jié)節(jié)組。BRAFV600E突變是目前已知甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的重要指標(biāo)，在可疑良性結(jié)節(jié)組檢出的10 例BRAFV600E突變樣本可能更傾向?yàn)榘┙M織。此10 例病例將進(jìn)行密切的跟蹤隨訪，以便觀察其結(jié)節(jié)的變化情況。而在后續(xù)的研究中，在B 超和細(xì)針穿刺活檢確定為良性結(jié)節(jié)之后，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行手術(shù)切除并通過病理學(xué)檢測確定其具體的組織學(xué)亞型。而且，本研究中的一些統(tǒng)計(jì)有邊緣效應(yīng)，可能因?yàn)檠芯康臉颖纠龜?shù)較少，因此需要進(jìn)一步增加樣本量來提高統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且深入探究上述基因變異對甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的影響。