原紅娟, 朱紅惠

一株誘導(dǎo)粘細(xì)菌子實(shí)體形成的被捕食菌的篩選及分子鑒定

原紅娟1,2, 朱紅惠2,*

1 運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系, 山西運(yùn)城 044000 2 廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070

為篩選適宜于誘導(dǎo)粘細(xì)菌子實(shí)體形成的被捕食菌, 利用誘導(dǎo)分離的方法, 從酵母菌、革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌共30株菌中進(jìn)行篩選, 利用掃描電鏡觀察形態(tài)特征, 通過16S rRNA確定系統(tǒng)分類地位, 并對(duì)其分離培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。獲得一株被捕食菌GIM1.767, 經(jīng)透射電子顯微鏡觀察長(zhǎng)約為1.2—1.24 μm, 寬度約為0.6—0.65 μm, 無鞭毛, 分子鑒定為s; 對(duì)分離培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化, 發(fā)現(xiàn)添加1% 酵母粉的WCX培養(yǎng)基, 對(duì)粘球菌屬能更好的分離誘導(dǎo)。分離得到菌株, 對(duì)挖掘粘細(xì)菌資源提供一些參考價(jià)值。

被捕食菌; 分離純化; 粘細(xì)菌

0 前言

粘細(xì)菌(myxobacteria)是一類可以通過分泌粘液來執(zhí)行滑行運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌, 能夠產(chǎn)生豐富的結(jié)構(gòu)新、種類多及作用機(jī)理新穎的活性物質(zhì), 是繼放線菌之后的又一重要藥源微生物新類群[1–2], 具有重要的潛在開發(fā)應(yīng)用前景[3]。

粘細(xì)菌在環(huán)境中廣泛存在, 并在一定的條件下形成肉眼可見的子實(shí)體[4-6]。在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上, 能夠形成粘液豐富的、薄而擴(kuò)展的菌落[7-9], 由其分泌的胞外粘液使子實(shí)體不易分散, 粘細(xì)菌生長(zhǎng)具有密度依賴性, 單細(xì)胞不易萌發(fā)生長(zhǎng)[10]且容易被污染; 在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上, 粘細(xì)菌不形成子實(shí)體只形成不擴(kuò)散的菌落, 造成粘細(xì)菌不能與其他細(xì)菌分開[11-12]。除此之外, 粘細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢, 易被其他生長(zhǎng)迅速的菌覆蓋或污染[13]。粘細(xì)菌的這些特性使得在分離純化粘細(xì)菌過程中存在許多問題, 也是制約一些研究者對(duì)其研究的主要原因。

粘細(xì)菌作為微生物中的捕食菌(Micropredators), 可以捕食和裂解其他活的或死的微生物[14-15], 主要通過粘細(xì)菌產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)如細(xì)胞裂解酶、抗生素、核酸酶、酯酶、蛋白酶和多糖酶裂解其他微生物細(xì)胞, 作為小分子物質(zhì)來滿足自身的營(yíng)養(yǎng)需求。根據(jù)其食性粘細(xì)菌分為兩大類群, 分別為溶細(xì)菌類群(Bacteriolytic group)和溶纖維素類群(Cellulolytic group)。粘細(xì)菌除捕食細(xì)菌外, 還可以真菌, 如酵母菌、真菌和綠藻。因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組分的不同, 使粘細(xì)菌對(duì)被捕食菌裂解的難易及嗜好不同。

熱帶森林土壤和腐爛的樹木是分離粘細(xì)菌, 發(fā)現(xiàn)新的粘細(xì)菌資源最好的來源[16]。而越南是典型的熱帶地區(qū), 有豐富的熱帶原始森林, 因此, 從熱帶原始森林腐木或土壤中分離粘細(xì)菌, 極有可能發(fā)掘到大量的粘細(xì)菌新資源, 得到功能新穎、遺傳背景多樣、且有重要利用價(jià)值的粘細(xì)菌資源, 從而為發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌新的活性物質(zhì)和新的功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究針對(duì)樣品的特性, 利用越南的土樣篩選出誘導(dǎo)效果較好的被捕食菌, 并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。依據(jù)誘導(dǎo)過程中存在的問題[17-19], 以及不同類群的粘細(xì)菌食性不同, 篩選的被捕食菌結(jié)合改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基, 使樣品中的粘細(xì)菌更易誘導(dǎo)分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

酵母菌:GIM2.6、GIM2.9、GIM 2.34、GIM2.84、GIM2.127、GIM2.132、GIM2.134、GIM2.149、GIM2.159、GIM2.173。

革蘭氏陰性菌:GIM1.223、GIM1.236、GIM1.224、GIM1.279、GIM1.767、GIM1.323、GIM1.205、GIM1.265、GIM1.331、GIM1.379、GIM1.767。

革蘭氏陽性菌:GIM 1.221、GIM1.276、GIM1.143、GIM1.247、GIMT1.083、GIMT1.058、GIMT1.044、GIMT 1.249、XJ1、XJ15。

以上菌種均由廣東省微生物菌種保和藏中心提供, GIM1.767、XJ1、XJ15為本實(shí)驗(yàn)室在新疆鹽堿地土壤中篩選的被捕食菌。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

① CY培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VY/2培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基(WCX)[20]

② R2A合成培養(yǎng)基

改良WCX培養(yǎng)基: CaCl2·2H2O 0.1%, 釀酒酵母1%, 瓊脂1.5%, pH 7.2。

改良WCX培養(yǎng)基: CaCl2·2H2O 0.1%, 胰蛋白胨0.3%, 瓊脂1.5%, pH 7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理

用加放線菌酮(終濃度100 μg·mL–1)的無菌水浸泡土樣過夜, 用3K30C 型冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)離心5 min(8000 r·min–1), 棄上清。

1.2.2 分離粘細(xì)菌

①將革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌接種于NA液體培養(yǎng)中, 37 ℃ 振蕩培養(yǎng)24 h, 酵母菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中, 28 ℃ 振蕩培養(yǎng)24 h。

②將30種菌液各取100 uL, 涂布于CY平板上, 過夜培養(yǎng), 將處理好的土樣, 接入長(zhǎng)滿菌的CY平板上, 30℃下誘導(dǎo)培養(yǎng), 每個(gè)處理重復(fù)三次。

③3天后置于在LEICA001型體式鏡(德國(guó)LEIKA公司)下觀察, 并挑取子實(shí)體于VY/2培養(yǎng)基上純化。

1.2.3 透射電鏡(transmission electricity microscope, TEM)觀察[20-21]

1.2.4 促進(jìn)粘細(xì)菌子實(shí)體形成效果評(píng)價(jià)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的被捕食菌液100 uL, 涂布于新鮮的CY培養(yǎng)基上, 每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù), 1h 晾干后, 將粘細(xì)菌用針頭接種至CY培養(yǎng)基上, 三天后觀察拍照, 評(píng)價(jià)子實(shí)體形成效果。

1.2.5 DNA的提取

采用改良CTAB法[22]提取純培養(yǎng)物DNA。

1.2.6 PCR擴(kuò)增

16S rRNA擴(kuò)增使用細(xì)菌通用引物[23-24], 引物由廣州英俊測(cè)序公司合成。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株16S rRNA基因序列利用BLAST搜索軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索, 使用CLUSTAL.X[25]軟件進(jìn)行序列比對(duì), 采用Neighbor- joining[26]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 被捕食菌的初步篩選

利用革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌各10種菌株(見1.1.1), 初步對(duì)越南三個(gè)土壤樣品進(jìn)行誘導(dǎo)研究, 由表1可知: ①從總體誘導(dǎo)效果上看革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)效果最好, 其次酵母菌, 革蘭氏陽性菌誘導(dǎo)效果最差; ②革蘭氏陽性菌能分離得到的粘細(xì)菌, 酵母菌和革蘭氏陰性菌均能分離得到, 即革蘭氏陽性菌分離得到的粘細(xì)菌種屬較少, 只有和兩個(gè)屬, 且主要為。③分離粘細(xì)菌顏色都較鮮亮, 但由于酵母菌在解剖鏡下顏色無色透亮, 因此分離一些顏色較淺的粘細(xì)菌比較困難, 或者會(huì)容易漏看(如圖1 I), 且多數(shù)酵母菌誘導(dǎo)時(shí), 如GIM2.6、GIM2.34、GIM2.84、GIM2.127、GIM 2.132、GIM2.149和GIM2.173, 培養(yǎng)基上易出現(xiàn)白色且硬的片狀物質(zhì)(見表1), 對(duì)純化過程造成一定的影響(如圖1 C)。④霉菌污染嚴(yán)重(如圖1 E、F、H), 特別是革蘭氏陽性菌,GIM1.276、GIM1.247、GIMT1.083、GIMT1.058和XJ15, 在4-5天就被霉菌覆蓋, 這可能與菌體自身的代謝有關(guān)。⑤由表1被捕食菌誘導(dǎo)效果可知, 土壤中易誘導(dǎo)的在本樣品中通過常規(guī)培養(yǎng)(CY培養(yǎng)基)不易誘導(dǎo)出, 且多數(shù)在2周左右才誘導(dǎo)出, 對(duì)之后的純化工作帶來很大的困難。

綜合以上結(jié)果, 在30株誘導(dǎo)菌中, 優(yōu)先選擇革蘭氏陰性菌, 而革蘭氏陰性菌中, 誘導(dǎo)效果最好的菌株為GIM1.767(見表1)。

2.2 被捕食菌的形態(tài)觀察

利用日立H-7650型透射電子顯微鏡, 利用對(duì)被捕食菌GIM1.767的形態(tài)進(jìn)行了觀察, 結(jié)果如圖2所示, 長(zhǎng)度約為1.2—1.24 μm, 寬度約為0.6—0.65μm, 無鞭毛。

注: A.E. coli GIM1.223; B. Staphylococcus sciuri GIMT1.249; C.Saccharomyces cerevisiae GIM2.132; D. Erwinia persicina GIM1.331; E. Klebsiella pneumonia GIM1.279; F. Candida utilis GIM2.9; G.Saccharomyces cerevisiae GIM2.127; H.Serratia marcescens GIM1.323; I.Debaryomyces hansenii GIM2.149)。

Figure 1 Rendering of three types of some prey bacteria induce fruiting body

表1 被捕食菌的誘導(dǎo)效果

2.3 被捕食菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

被捕食菌的誘導(dǎo)效果, 通常利用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行涂布或劃線誘導(dǎo)。由圖3(A圖) 菌株GIM1.767的生長(zhǎng)曲線可知, 菌株GIM1.767在2.0 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 生長(zhǎng)1.5 h后達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期。而的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)(圖3 B圖), 從2 h開始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 至7 h達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期, 即的的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大約5小時(shí), 較菌株GIM1.767的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)近3.5h。

2.4 菌株GIM1.767的分子鑒定

將被捕食菌GIM1.767的16S rRNA基因的序列利用BLAST搜索軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索, 并調(diào)取相關(guān)種屬的相近模式菌的16S rRNA序列, 以ATCC 25416T為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果顯示, 被捕食菌GIM1.767與菌株S1Y1- bLLT、NG-R17T和DPN7T的相似性均達(dá)99%。使用CLUSTAL.X(Thompson., 1997)軟件進(jìn)行序列比對(duì), 利用MEGA4.0的Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4), 系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, 菌株GIM1.767與的進(jìn)化距離較近, 應(yīng)歸類于。

圖2 被捕食菌GIM1.767透射電鏡形態(tài)圖(0.5 μm)

Figure 2 Transmission electricity microscope observation of predation GIM1.767

注: A. GIM1.767的生長(zhǎng)曲線; B. E. coli的生長(zhǎng)曲線。

Figure 3 Growth curve of prey bacteria

注: 標(biāo)尺代表進(jìn)化樹的進(jìn)化距離, 括號(hào)中的內(nèi)容代表菌株的登錄號(hào), Burkholderia cepacia ATCC 25416T作為外類群

Figure 4 Molecular identification of strain GIM1.767 based on 16S rRNA gene sequence

2.5 菌株GIM1.767誘導(dǎo)粘細(xì)菌子實(shí)體形成的培養(yǎng)基的優(yōu)化

分離越南土壤樣品的過程中, 發(fā)現(xiàn)土壤中易分離的粘球菌屬不易誘導(dǎo), 或在10至14天才被誘導(dǎo)出, 但此時(shí)因霉菌污染使其不易純化, 因此, 設(shè)計(jì)了兩種優(yōu)化培養(yǎng)基, 以基礎(chǔ)的WCX分離培養(yǎng)基為對(duì)照, 分別在WCX培養(yǎng)基中添加適量的酵母提取物(1%)、胰蛋白胨(0.3%)及R2A培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基, 利用誘導(dǎo)菌GIM1.767進(jìn)行劃十字線分離粘細(xì)菌。由表2、圖5可知, 添加胰蛋白胨的分離培養(yǎng)基誘導(dǎo)不出或能誘導(dǎo)出極少數(shù)的粘細(xì)菌, 且形成的子實(shí)體不明顯或無子實(shí)體形態(tài)。其余三種分離培養(yǎng)基, 誘導(dǎo)出的粘細(xì)菌種類和顏色差異不大, 但誘導(dǎo)粘球菌屬在時(shí)間上有差異, WCX需12—14天, R2A培養(yǎng)基10—12天, WCX添加酵母提取物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間最短, 需5—7天。誘導(dǎo)的粘細(xì)菌子實(shí)體大小上, WCX與添加酵母提取物的WCX無明顯差異, 但R2A誘導(dǎo)的粘細(xì)菌子實(shí)體較小。

表2 幾種誘導(dǎo)粘細(xì)菌子實(shí)體形成的培養(yǎng)基

注: A. WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的M. Xanthus; B. 添加1%酵母提取物的WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的M. Xanthus; C. 添加0.3%胰蛋白胨的WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的M. Virescens; D. R2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的M. Xanthus; E. 添加1%酵母提取物的WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的C. Coralloides; F. 添加0.3%胰蛋白胨的WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的C.coralloides; G. WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的Cystobacer; H. 添加1%酵母提取物的WCX培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的Cystobacer; I. R2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的Cystobacer。

Figure 5 Rendering of three types of some prey bacteria GIM1.767 induce fruiting body (day 8)

以上結(jié)果顯示, 分離越南土壤樣品最適宜的培養(yǎng)基為WCX添加酵母提取物的培養(yǎng)基。

3 討論

粘細(xì)菌的研究自1809年至今已經(jīng)歷了200多年, 由于分離純化技術(shù)的限制, 目前已經(jīng)描述的粘細(xì)菌只有7個(gè)科, 24屬, 56個(gè)種[27-29]。分離技術(shù)限制的原因之一就是被捕食菌, 一般分離粘細(xì)菌通常選用易捕食的革蘭氏陰性大腸桿菌[30], 但被捕食菌也可以選取酵母菌或革蘭氏陽性菌。粘細(xì)菌作為微生物群體中的捕食者, 由于其偏好性或捕食機(jī)理的差異, 相同環(huán)境下粘細(xì)菌捕食的對(duì)象可能不同。李百元等[31]在利用被捕食細(xì)菌誘導(dǎo)分離新疆鹽堿地粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn), 在相同的培養(yǎng)環(huán)境下,只捕食了革蘭氏陽性菌。本研究利用被捕食菌捕食的偏好性不同, 選取30種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌對(duì)越南三個(gè)樣品進(jìn)行誘導(dǎo)研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)效果最好, 子實(shí)體明顯, 顏色鮮艷, 誘導(dǎo)的種類較多, 且不會(huì)產(chǎn)生白色片狀物質(zhì); 并結(jié)合各種誘導(dǎo)因素(見表1)選取了一株革蘭氏陰性菌GIM1.767作為最佳的被捕食菌; 通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 被捕食菌GIM1.767的形態(tài)為無鞭毛, 長(zhǎng)度約為1.2—1.24 μm, 寬度約為0.6—0.65 μm。菌株GIM1.767的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在2.5—4 h。在CY培養(yǎng)基上, 被捕食菌促進(jìn)粘細(xì)菌子實(shí)體形成效果顯示, 菌株GIM1.767比誘導(dǎo)的子實(shí)體形成的時(shí)間提早2天左右, 為后期分離純化粘細(xì)菌不易被霉菌污染提供了有利的時(shí)間保障, 通過16S rRNA基因的分子鑒定, 菌株GIM1.767屬于。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為重要的部分, 是土壤分解系統(tǒng)中的主要成分, 而捕食菌通過捕食其他微生物, 來控制土壤微生物的數(shù)量, 從而影響微生物的群體結(jié)構(gòu)[32-34]。通過16S rRNA基因的分子鑒定, 菌株GIM1.767屬于, 經(jīng)培養(yǎng)基的優(yōu)化, 其分離粘細(xì)菌最佳培養(yǎng)基為WCX添加1%的酵母提取物的培養(yǎng)基。

通過本實(shí)驗(yàn)篩選得到菌株GIM1.767, 說明不同生境的粘細(xì)菌對(duì)被捕食菌的偏好性不同, 其原因可能與被捕食產(chǎn)生的氣體、代謝產(chǎn)物及其滑行機(jī)制有關(guān)[35], 需進(jìn)一步研究, 其研究結(jié)果為分離純化粘細(xì)菌提供一些應(yīng)用參考價(jià)值。

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Screening and molecular identification of a predator inducing the formation of myxobacterial fruiting bodies

YUAN Hongjuan1,2, ZHU Honghui2,*

1 Department of Life Science, Yuncheng University, Shanxi 044000, China 2 Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology. Guangzhou 510070, China

In order to screen the predatory bacteria suitable for inducing the formation of myxobacteria fruiting bodies, the induced separation method was performed to select 30 stains from microbes including yeasts, Gram negative and Gram positive bacteria. Subsequently, the morphological characteristics were observed by scanning electron microscope and phylogentic position was analyzed based on 16S rRNA. In addition, the isolation medium was optimized. One prey bacterium GIM1.767 was identified as. According to scanning electron microscope, its length and width were 1.2-1.24 μm and 0.6-0.65 μm, respectively, without flagella. Optimization of isolation medium found that the WCX medium with 1% yeast extract was effective to separate thestrains. Isolation of strainhad certain reference application value to excavate myxobacteria resources..

preybaceria; islation purification; myxobacteria

原紅娟, 朱紅惠. 一株誘導(dǎo)粘細(xì)菌子實(shí)體形成的被捕食菌的篩選及分子鑒定[J]. 生態(tài)科學(xué), 2021, 40(4): 113–120.

YUAN Hongjuan, ZHU Honghui. Screening and molecular identification of a predator inducing the formation of myxobacterial fruiting bodies[J]. Ecological Science, 2021, 40(4): 113–120.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.04.013

Q936.2

A

1008-8873(2021)04-113-08

2020-02-07;

2020-05-18

山西省面上青年基金項(xiàng)目(No. 201601D202061); 廣東省國(guó)際合作項(xiàng)目(No.2012B050700009); 運(yùn)城學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(No.YQ-2017009);山西省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助(No.FSKSC)

原紅娟(1978—), 女, 山西運(yùn)城, 博士, 副教授, 主要從微生物資源開發(fā)研究, E-mail:yhj1793@163.com

朱紅慧, 女, 博士, 主要從事微生物研究, E-mail: zhuhh@gdim.cn