曾愛英 廖星 戴木森

（1 福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院 福州350001；2 福建省立醫(yī)院急診內科 福州350001）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa, Pa）是一種革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，是院內感染最常見的細菌之一，常見于燒傷后的繼發(fā)感染、尿路感染、血流感染、囊性支氣管擴張、二重感染及免疫抑制患者的繼發(fā)感染，位居臨床非發(fā)酵菌檢出率的首位[1~2]。 隨著抗生素的濫用，多重耐藥菌株不斷出現，而導致耐藥產生的一個重要機制就是生物被膜（BF）的形成。研究發(fā)現磷霉素（FOS）可破壞形成的BF，與其他抗生素聯合使用時對BF 內細菌有協(xié)同殺菌作用[3]。本研究探討FOS 對Pa 的BF 的影響及對美羅培南（MEM）的增效作用，為臨床多重耐藥Pa 感染的治療提供參考。 現報道如下：

1 材料與方法

1.1 菌株來源 從臨床收集Pa 菌株（編號為12078）及質控菌株ATCC29953 均由福建省立醫(yī)院微生物檢驗中心鑒定及提供。

1.2 藥物與試劑 FOS 為標準品，購于中國藥品生物制品檢定所；MEM 標準品，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 實驗方法

1.3.1 最 低 抑 菌 濃 度 （Minimal Inhibitory Concentration, MIC）的測定 參照美國2014 CLSI 微量肉湯稀釋法[4]測定臨床分離Pa12078，以肉眼觀察無細菌生長的最低藥物質量濃度為MIC。ATCC29953 作為質量控制菌株。

1.3.2 BF 的制備 將Pa 復壯于無菌LB 瓊脂平板上， 過夜后挑取單個菌落接種于盛有50 ml 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）的燒瓶中，置于恒溫搖床（37℃，180 r/min）過夜，次日用新鮮TSB 過夜培養(yǎng)菌液稀釋成 OD600=0.2（菌液濃度約為 5.0×108CFU/L）。 將無菌14 mm 的載體分別放入無菌24 孔板中， 隨后每孔加入2 ml 稀釋好的菌液， 放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 隔日更換培養(yǎng)液。 7 d 載體表面形成成熟BF。

1.3.3 結晶紫染色法半定量BF Pa 的BF 載體經0.9%的無菌氯化鈉溶液漂洗3 遍，晾干后放入另一24 孔板中，每孔加入0.1%的結晶紫染液1 ml，染色15 min，再用0.9%氯化鈉溶液漂洗至清亮，然后晾干載體。 取1 ml 95%乙醇溶解BF 上的結晶紫5 min。 取 200 μl 加入 96 孔板，多功能酶標儀 570 nm波長處測定吸光度值。

1.3.4 實驗分組及處理 分為空白對照組、FOS組、MEM 組、FOS+MEM 組。 FOS 及 MEM 的濃度分別為 64 μg/ml 和 16 μg/ml。 于建模第 7 天，用0.9%氯化鈉溶液將附有BF 的載體輕輕漂洗， 去除浮游菌， 按實驗分組然后分別加入FOS、MEM、FOS+MEM，每孔2 ml，37℃恒溫培養(yǎng)。 各組分別于藥物作用4 h、8 h、24 h 后取出載體，再次用0.9%氯化鈉溶液漂洗載體，后將載體置于盛有2 ml 0.9%氯化鈉溶液的試管中，用漩渦震蕩儀震蕩試管，使細菌脫落至氯化鈉溶液中形成菌懸液， 采用連續(xù)稀釋進行菌落計數，計數每毫升菌懸液的活菌數（CFU/ml），結果用（）表示，每個時間點每個實驗組計數4份載體，每次重復測量3 次后取平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件包進行單因素方差分析，檢驗水準為α=0.05。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MIC 測 定結果 FOS 及 MEM 對 Pa12078 的MIC 分別為 128 μg/ml 及 32 μg/ml。

2.2 結晶紫半定量結果 空白對照組24 h 吸光度值無明顯變化（P＞0.05）。 MEM 組 4 h、8 h、24 h 時吸光度值與空白對照組比較， 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 FOS 組24 h 時吸光度值低于空白對照組（P＜0.05）。 FOS+MEM 組 8 h 時吸光度值開始比空白對照組低（P＜0.01）。 見表 1。

表1 不同藥物作用后半定量結果（）

表1 不同藥物作用后半定量結果（）

注：與空白對照組同時間點比較，*P＜0.05，與對照組比較，#P＜0.01。

組別 n 4 h 8 h 24 h空白對照組FOS 組MEM 組FOS+MEM 組4444 2.46±0.19 2.20±0.17 2.41±0.19 2.11±0.30 2.26±0.16 1.93±0.44 2.14±0.42 1.50±0.33#2.20±0.24 1.48±0.43*2.18±0.26 0.82±0.10#

2.3 BF 經FOS、MEM 及二者聯合應用后活菌數變化 空白對照組BF 內活菌數24 h 無明顯變化（P＞0.05）。 FOX 組、MEM 組 4 h、8 h、24 h 時 BF 內活菌數與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 FOS+MEM 聯合用藥組 4 h、8 h、24 h 時 BF內活菌數均比空白對照組少（P＜0.01）。 見表2。

表2 不同藥物作用后活菌數（lgCFU/ml，）

表2 不同藥物作用后活菌數（lgCFU/ml，）

注：與空白對照組同時間點比較，*P＜0.01。

組別 n 4 h 8 h 24 h空白對照組FOS 組MEM 組FOS+MEM 組4444 7.78±0.05 7.74±0.06 7.70±0.08 7.06±0.06*7.54±0.37 7.39±0.31 7.51±0.31 6.36±0.24*7.51±0.47 7.26±0.40 7.28±0.43 6.01±0.37*

3 討論

近年研究發(fā)現抗生素的耐藥、院內感染都與細菌BF 形成有關。 Pa 是院內感染患者標本中分離率較高的一種病原菌，極易形成BF。 BF 的形成使Pa能防御吞噬細胞的作用，逃避宿主免疫反應，導致耐藥，為臨床治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)[5]。 碳青霉烯類藥物的廣泛使用、重癥監(jiān)護病房治療和機械通氣均可引起Pa 耐藥[6]。MEM 是臨床治療Pa 的常用抗生素之一，但Pa 對 MEM 耐藥率也趨于增長[7]。 Pa 對碳青霉烯類耐藥的一個重要原因是細菌外層細胞壁的特異外膜通道蛋白丟失，造成細胞壁低滲透性，使碳青酶烯類抗生素無法進入細菌體內， 而細菌在BF 屏蔽下可逃避抗菌藥物殺傷作用，從而導致細菌耐藥[8]，抗感染治療失敗。 FOS 是一種磷酸類化學合成的廣譜抗生素，但抗菌活性不大，臨床常用于敏感菌引起的輕中度感染。 其抗菌作用機制是通過抑制磷酸烯醇丙酮酸合成酶阻斷肽聚糖合成的第一步， 從而干擾細菌細胞壁合成。 有研究表明，磷霉素與喹諾酮類、β 內酰胺類藥物聯合應用， 在抗BF 和多重耐藥細菌方面表現出了協(xié)同效應[9]。

本實驗結果顯示，應用FOS 24 h 后Pa 的BF 吸光度值小于空白對照組（P＜0.05），說明FOS 能破壞Pa 的BF；而MEM 單獨應用后吸光度值、活菌計數與空白對照組相比， 差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明 MEM 對 Pa 的 BF 及 BF 內活菌無明顯作用； 當兩藥合用后吸光度值于8 h 起即低于空白對照組（P＜0.01），活菌計數于4 h 起即低于空白對照組（P＜0.01），存活細菌數明顯減少，推測兩藥合用后可能加速了Pa 的BF 的破壞， 從而增強了MEM 的滲透及對BF 內Pa 的殺滅， 顯示出了協(xié)同殺菌作用。以上研究結果說明Pa 對MEM 耐藥的機制可能是BF 的屏障作用限制了MEM 進入BF 內，使得BF 內MEM 達不到有效殺菌濃度， 從而無法發(fā)揮殺菌作用，而FOS 具有破壞耐藥Pa 的BF 或抑制其形成的作用。兩者聯用對耐碳青霉烯類Pa 能發(fā)揮增效協(xié)同作用。 但其具體效果尚需動物實驗及體內試驗加以證實。