曾愛英 廖星 戴木森

（1 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福州350001；2 福建省立醫(yī)院急診內(nèi)科 福州350001）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa, Pa）是一種革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，是院內(nèi)感染最常見的細(xì)菌之一，常見于燒傷后的繼發(fā)感染、尿路感染、血流感染、囊性支氣管擴(kuò)張、二重感染及免疫抑制患者的繼發(fā)感染，位居臨床非發(fā)酵菌檢出率的首位[1~2]。 隨著抗生素的濫用，多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，而導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生的一個(gè)重要機(jī)制就是生物被膜（BF）的形成。研究發(fā)現(xiàn)磷霉素（FOS）可破壞形成的BF，與其他抗生素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)BF 內(nèi)細(xì)菌有協(xié)同殺菌作用[3]。本研究探討FOS 對(duì)Pa 的BF 的影響及對(duì)美羅培南（MEM）的增效作用，為臨床多重耐藥Pa 感染的治療提供參考。 現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 菌株來源 從臨床收集Pa 菌株（編號(hào)為12078）及質(zhì)控菌株ATCC29953 均由福建省立醫(yī)院微生物檢驗(yàn)中心鑒定及提供。

1.2 藥物與試劑 FOS 為標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；MEM 標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最 低 抑 菌 濃 度 （Minimal Inhibitory Concentration, MIC）的測(cè)定 參照美國(guó)2014 CLSI 微量肉湯稀釋法[4]測(cè)定臨床分離Pa12078，以肉眼觀察無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度為MIC。ATCC29953 作為質(zhì)量控制菌株。

1.3.2 BF 的制備 將Pa 復(fù)壯于無菌LB 瓊脂平板上， 過夜后挑取單個(gè)菌落接種于盛有50 ml 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）的燒瓶中，置于恒溫?fù)u床（37℃，180 r/min）過夜，次日用新鮮TSB 過夜培養(yǎng)菌液稀釋成 OD600=0.2（菌液濃度約為 5.0×108CFU/L）。 將無菌14 mm 的載體分別放入無菌24 孔板中， 隨后每孔加入2 ml 稀釋好的菌液， 放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 隔日更換培養(yǎng)液。 7 d 載體表面形成成熟BF。

1.3.3 結(jié)晶紫染色法半定量BF Pa 的BF 載體經(jīng)0.9%的無菌氯化鈉溶液漂洗3 遍，晾干后放入另一24 孔板中，每孔加入0.1%的結(jié)晶紫染液1 ml，染色15 min，再用0.9%氯化鈉溶液漂洗至清亮，然后晾干載體。 取1 ml 95%乙醇溶解BF 上的結(jié)晶紫5 min。 取 200 μl 加入 96 孔板，多功能酶標(biāo)儀 570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 分為空白對(duì)照組、FOS組、MEM 組、FOS+MEM 組。 FOS 及 MEM 的濃度分別為 64 μg/ml 和 16 μg/ml。 于建模第 7 天，用0.9%氯化鈉溶液將附有BF 的載體輕輕漂洗， 去除浮游菌， 按實(shí)驗(yàn)分組然后分別加入FOS、MEM、FOS+MEM，每孔2 ml，37℃恒溫培養(yǎng)。 各組分別于藥物作用4 h、8 h、24 h 后取出載體，再次用0.9%氯化鈉溶液漂洗載體，后將載體置于盛有2 ml 0.9%氯化鈉溶液的試管中，用漩渦震蕩儀震蕩試管，使細(xì)菌脫落至氯化鈉溶液中形成菌懸液， 采用連續(xù)稀釋進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)每毫升菌懸液的活菌數(shù)（CFU/ml），結(jié)果用（）表示，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組計(jì)數(shù)4份載體，每次重復(fù)測(cè)量3 次后取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIC 測(cè) 定結(jié)果 FOS 及 MEM 對(duì) Pa12078 的MIC 分別為 128 μg/ml 及 32 μg/ml。

2.2 結(jié)晶紫半定量結(jié)果 空白對(duì)照組24 h 吸光度值無明顯變化（P＞0.05）。 MEM 組 4 h、8 h、24 h 時(shí)吸光度值與空白對(duì)照組比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 FOS 組24 h 時(shí)吸光度值低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。 FOS+MEM 組 8 h 時(shí)吸光度值開始比空白對(duì)照組低（P＜0.01）。 見表 1。

表1 不同藥物作用后半定量結(jié)果（）

表1 不同藥物作用后半定量結(jié)果（）

注：與空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05，與對(duì)照組比較，#P＜0.01。

組別 n 4 h 8 h 24 h空白對(duì)照組FOS 組MEM 組FOS+MEM 組4444 2.46±0.19 2.20±0.17 2.41±0.19 2.11±0.30 2.26±0.16 1.93±0.44 2.14±0.42 1.50±0.33#2.20±0.24 1.48±0.43*2.18±0.26 0.82±0.10#

2.3 BF 經(jīng)FOS、MEM 及二者聯(lián)合應(yīng)用后活菌數(shù)變化 空白對(duì)照組BF 內(nèi)活菌數(shù)24 h 無明顯變化（P＞0.05）。 FOX 組、MEM 組 4 h、8 h、24 h 時(shí) BF 內(nèi)活菌數(shù)與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 FOS+MEM 聯(lián)合用藥組 4 h、8 h、24 h 時(shí) BF內(nèi)活菌數(shù)均比空白對(duì)照組少（P＜0.01）。 見表2。

表2 不同藥物作用后活菌數(shù)（lgCFU/ml，）

表2 不同藥物作用后活菌數(shù)（lgCFU/ml，）

注：與空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.01。

組別 n 4 h 8 h 24 h空白對(duì)照組FOS 組MEM 組FOS+MEM 組4444 7.78±0.05 7.74±0.06 7.70±0.08 7.06±0.06*7.54±0.37 7.39±0.31 7.51±0.31 6.36±0.24*7.51±0.47 7.26±0.40 7.28±0.43 6.01±0.37*

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)抗生素的耐藥、院內(nèi)感染都與細(xì)菌BF 形成有關(guān)。 Pa 是院內(nèi)感染患者標(biāo)本中分離率較高的一種病原菌，極易形成BF。 BF 的形成使Pa能防御吞噬細(xì)胞的作用，逃避宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致耐藥，為臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[5]。 碳青霉烯類藥物的廣泛使用、重癥監(jiān)護(hù)病房治療和機(jī)械通氣均可引起Pa 耐藥[6]。MEM 是臨床治療Pa 的常用抗生素之一，但Pa 對(duì) MEM 耐藥率也趨于增長(zhǎng)[7]。 Pa 對(duì)碳青霉烯類耐藥的一個(gè)重要原因是細(xì)菌外層細(xì)胞壁的特異外膜通道蛋白丟失，造成細(xì)胞壁低滲透性，使碳青酶烯類抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)， 而細(xì)菌在BF 屏蔽下可逃避抗菌藥物殺傷作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[8]，抗感染治療失敗。 FOS 是一種磷酸類化學(xué)合成的廣譜抗生素，但抗菌活性不大，臨床常用于敏感菌引起的輕中度感染。 其抗菌作用機(jī)制是通過抑制磷酸烯醇丙酮酸合成酶阻斷肽聚糖合成的第一步， 從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成。 有研究表明，磷霉素與喹諾酮類、β 內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合應(yīng)用， 在抗BF 和多重耐藥細(xì)菌方面表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用FOS 24 h 后Pa 的BF 吸光度值小于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明FOS 能破壞Pa 的BF；而MEM 單獨(dú)應(yīng)用后吸光度值、活菌計(jì)數(shù)與空白對(duì)照組相比， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明 MEM 對(duì) Pa 的 BF 及 BF 內(nèi)活菌無明顯作用； 當(dāng)兩藥合用后吸光度值于8 h 起即低于空白對(duì)照組（P＜0.01），活菌計(jì)數(shù)于4 h 起即低于空白對(duì)照組（P＜0.01），存活細(xì)菌數(shù)明顯減少，推測(cè)兩藥合用后可能加速了Pa 的BF 的破壞， 從而增強(qiáng)了MEM 的滲透及對(duì)BF 內(nèi)Pa 的殺滅， 顯示出了協(xié)同殺菌作用。以上研究結(jié)果說明Pa 對(duì)MEM 耐藥的機(jī)制可能是BF 的屏障作用限制了MEM 進(jìn)入BF 內(nèi)，使得BF 內(nèi)MEM 達(dá)不到有效殺菌濃度， 從而無法發(fā)揮殺菌作用，而FOS 具有破壞耐藥Pa 的BF 或抑制其形成的作用。兩者聯(lián)用對(duì)耐碳青霉烯類Pa 能發(fā)揮增效協(xié)同作用。 但其具體效果尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)試驗(yàn)加以證實(shí)。