熊瑋 王萍 曾玉蘭 周薇 彭紅星 周月泉

肺動脈高壓是以出現(xiàn)右心衰竭或全心衰竭為特征的嚴(yán)重難治性疾病，而肺血管重塑引起壓力性血流受阻是肺動脈高壓的重要病理特征，也是其中心環(huán)節(jié)[1]。吸煙是公認(rèn)的嚴(yán)重社會危害行為，煙草煙霧中的尼古丁等多種生物堿及含硫化合物不僅可誘發(fā)肺癌，引起慢性支氣管炎或哮喘急性發(fā)作，還可誘發(fā)肺血管重塑。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號通路參與血管平滑肌細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮再生及新生血管的形成，在血管重塑中發(fā)揮重要作用[2]。他汀類藥物廣泛用于調(diào)脂、穩(wěn)定動脈斑塊等，而其抗炎、抗平滑肌增殖、進(jìn)而減輕血管周圍炎癥反應(yīng)、擴(kuò)張血管及降低血流阻力等作用近年來也得到廣泛關(guān)注[3-5]。目前他汀類藥物已應(yīng)用于肺動脈高壓的治療中且初見成效，但他汀類藥物影響肺血管重塑的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。近年來發(fā)現(xiàn)，免疫分子TLR4參與肺血管重塑，本研究通過對煙霧暴露建立的肺血管重塑大鼠模型進(jìn)行藥物干預(yù)治療，觀察他汀類藥物對TLR4的表達(dá)及血管重塑的影響，以期為他汀類藥物對肺動脈高壓的治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料:清潔級健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量190～210 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。兔抗TLR4多克隆抗體試劑盒購自武漢谷歌生物公司,Trizol試劑盒購自Ambion公司，Mix試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒均購自Invitrogen公司，β-actin引物由武漢谷歌生物公司合成。奧林巴斯光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自日本TOYOBO公司，N2分光光度計(jì)購自上海精科，醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)型號為HMIAS-2000(武漢千屏影像公司)。

2.方法

(1)實(shí)驗(yàn)分組和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽洌簩D大鼠隨機(jī)分為正常對照組、煙霧暴露組和辛伐他汀干預(yù)組,每組各10只。正常對照組大鼠吸入新鮮空氣，常規(guī)食物喂養(yǎng)。煙霧暴露組和辛伐他汀組大鼠煙霧暴露方法如下：接受煙霧暴露的大鼠在暴露期間，轉(zhuǎn)移于點(diǎn)燃香煙的煙霧暴露箱內(nèi)，煙霧暴露箱體大小約為105 cm×60 cm×50 cm，香煙每次20支，焦油含量8 mg，用測氧儀監(jiān)測箱體中的氧濃度(21%左右)，根據(jù)氧濃度測量結(jié)果來決定通氣孔的個(gè)數(shù)。煙霧暴露組大鼠每天煙霧暴露2次，每次1小時(shí)，兩次暴露之間至少間隔4小時(shí)，暴露時(shí)間為8周；辛伐他汀干預(yù)組大鼠煙霧暴露方法和時(shí)間同煙霧暴露組，且在暴露時(shí)間內(nèi)每日早上9時(shí)左右以10 mg/kg辛伐他汀鼻飼灌胃1次。

(2)病理標(biāo)本制作:3組大鼠均于第8周結(jié)束造模，用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)麻醉大鼠后，放血處死，迅速得到病理標(biāo)本。取右肺動脈凍存于-80 ℃冰箱，備存用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測；取左主支氣管，按常規(guī)步驟制成石蠟切片，用于蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色。

(3)HE染色:在光學(xué)顯微鏡下，觀察各組大鼠標(biāo)本肺血管及肺泡的病理變化情況。嚴(yán)格挑選出厚度約為4 μm的切片進(jìn)行HE染色，每張切片選取肺血管結(jié)構(gòu)完整且直徑為50～200 μm的5支肺血管作為觀察對象，采用醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)測量血管的內(nèi)徑和外徑，計(jì)算血管壁厚度、血管壁面積和血管總面積，并計(jì)算管壁面積/血管總面積(WA%)、管壁厚度/血管外徑(WT%)。

(4)免疫組織化學(xué)染色法檢測肺動脈TLR4的表達(dá):實(shí)驗(yàn)采用PV6000二步法進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟如下：在光學(xué)顯微鏡下觀察，選取厚度約4μm的病理切片，用于免疫組化。首先按照常規(guī)步驟脫蠟水化，經(jīng)過酸化、修復(fù)，室溫孵育后，加入兔抗TLR4多克隆抗體，在4℃環(huán)境下過夜，再加DAB顯色試劑顯色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)視野下，隨機(jī)選取直徑約100～200 μm動脈5支，每組隨機(jī)選取25個(gè)視野。后采集圖像，并測定每個(gè)視野下陽性細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量，用彩色圖文分析系統(tǒng)計(jì)算出平均積分吸光度值(IA)。肺動脈陽性染色的判斷標(biāo)準(zhǔn)：肺動脈壁上出現(xiàn)棕黃色顆粒。

(5)RT-PCR檢測肺動脈TLR4 mRNA的表達(dá):取出預(yù)留凍存的肺動脈，按照Trizol試劑盒提供的步驟提取各組肺動脈總RNA,取1 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作)，提取1 μl的cDNA用于實(shí)驗(yàn)，按試劑盒說明書取吸光度值為1.8～2.0的cDNA用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。TLR4上游引物為5’-TATCCAGAGCCGTTGGTGTATCT-3’，下游引物為3’-AATGAAGATGATGCCAGAGCG-5’，擴(kuò)增長度為85 bp;內(nèi)參β-actin上游引物為5’-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3’，下游引物為3’-TTGCTGACAATCTCTTGAGGGAG-5’,擴(kuò)增長度為201 bp。TLR4反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)；最后由計(jì)算機(jī)計(jì)算各組Ct值，采用ΔΔCt進(jìn)行相對定量分析。目的mRNA含量=2-ΔΔCt。

結(jié) 果

1.3組大鼠WA%、WT%比較:煙霧暴露組和辛伐他汀組大鼠WA%、WT%明顯高于正常對照組，辛伐他汀組大鼠WA%、WT%明顯低于煙霧暴露組(P<0.05)，見表1。

2.3組大鼠肺血管典型HE染色結(jié)果：正常對照組大鼠肺泡相對完整，肺動脈管腔規(guī)則，管壁無明顯增厚，血管周圍炎性細(xì)胞較少；煙霧暴露組大鼠肺泡可見明顯融合，肺動脈管壁可見鋸齒狀改變，管腔變形，血管周圍炎性細(xì)胞增多；辛伐他汀組大鼠肺泡亦可見融合情況，但較煙霧暴露組減輕，肺動脈壁增厚及管腔變形情況有所改善，血管周圍炎性細(xì)胞較煙霧暴露組少。見圖1。

圖1 3組大鼠肺血管HE染色結(jié)果(A：正常對照組；B：煙霧暴露組；C：辛伐他汀組；×200)

3.3組大鼠肺動脈TLR4蛋白表達(dá)水平比較:煙霧暴露組(0.54±0.09)和辛伐他汀組(0.34±0.07)肺動脈TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對照組(0.28±0.09)，辛伐他汀組TLR4蛋白表達(dá)水平明顯低于煙霧暴露組(P<0.05)。

4.3組大鼠肺動脈典型TLR4免疫組化染色結(jié)果：正常對照組大鼠肺動脈陽性染色較淺，煙霧暴露組大鼠肺動脈陽性染色明顯加深，辛伐他汀組大鼠肺動脈染色程度介于對照和煙霧暴露組之間。見圖2。

圖2 3組大鼠肺動脈典型TLR4免疫組化染色結(jié)果(A：正常對照組；B：煙霧暴露組；C：辛伐他汀組；×200)

5.3組大鼠肺動脈TLR4 mRNA表達(dá)水平比較:煙霧暴露組(3.81±0.32)和辛伐他汀組(1.31±0.23)大鼠肺動脈TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組(1.00±0.12)，辛伐他汀組大鼠肺血管TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯低于煙霧暴露組(P<0.05)。

6.相關(guān)分析結(jié)果：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，TLR4 mRNA與WA%(r=0.888)、WT%(r=0.767)均呈正相關(guān)(P<0.05)。

討 論

肺血管重塑過程也是血管慢性炎癥過程，且肺血管重塑廣泛參與慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(ITP)及其他慢性肺部炎癥性疾病的病程[6]。TLR4是體內(nèi)重要的免疫分子，在免疫反應(yīng)、炎癥損傷、脂質(zhì)代謝之間發(fā)揮紐帶作用，TLR4活化后在血管慢性炎癥方面發(fā)揮重要作用，且TLR4/NF-κB信號通路參與肺血管增生或新生及冠狀動脈硬化等血管性疾病的重要環(huán)節(jié)[7-8]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)煙霧暴露會影響TLR4的表達(dá)，且TLR4的表達(dá)與肺血管重塑相關(guān)，具體機(jī)制可能與TLR4/NF-κB信號通路活化后炎癥因子釋放增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)血管平滑肌增生有關(guān)[9]。廣泛用于降脂、調(diào)脂穩(wěn)定斑塊的羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑除具有調(diào)脂作用外，在抗炎、抗血管增殖、誘導(dǎo)血管平滑肌凋亡等方面發(fā)揮重要作用[10]，已被用于肺動脈高壓及動脈硬化的防治。辛伐他汀是第一代HMG-CoA還原酶抑制劑的代表藥物，且已有用于肺動脈高壓治療的實(shí)例。盡管如此，辛伐他汀在肺動脈高壓的治療中仍處于初級階段，對肺血管重塑的藥理機(jī)制還不甚明確。因此本實(shí)驗(yàn)通過對煙霧暴露后發(fā)生肺血管重塑的大鼠模型加以辛伐他汀干預(yù)，觀察其對血管的保護(hù)作用，并初步探討其與近年來發(fā)現(xiàn)的TLR4是否關(guān)聯(lián)。

缺氧缺血、大氣污染、細(xì)菌或病毒感染等均可誘發(fā)肺血管炎癥改變。本實(shí)驗(yàn)通過煙霧暴露制備肺血管炎癥損傷模型，對大鼠口服辛伐他汀干預(yù)治療，觀察其肺血管重塑改變。2003年Nishimura等[11]提出他汀類藥物可通過抗炎機(jī)制在減輕血管重塑中發(fā)揮作用；2011年陳丹丹等[12]對比格犬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)他汀類藥物通過抑制比格犬白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子等炎癥因子的釋放減輕血管重塑，改善肺動脈高壓，而本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀干預(yù)治療后，大鼠肺血管管壁增厚及變形情況有所減輕，且在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)血管周圍炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示辛伐他汀對血管重塑有改善作用，且可能與減少炎癥細(xì)胞浸潤有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，證實(shí)辛伐他汀在煙霧暴露大鼠肺血管重塑治療中，發(fā)揮了一定作用。

他汀類藥物在干預(yù)血管炎癥方面的作用已成為研究熱點(diǎn)。目前已有動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)他汀類藥物對TLR4有調(diào)節(jié)作用。許旭光等[13]通過對大鼠鼻飼辛伐他汀后，檢測到TLR4蛋白表達(dá)水平受到抑制，大鼠動脈硬化程度減輕，且TLR4蛋白表達(dá)水平與辛伐他汀的濃度有關(guān)，其機(jī)制可能與辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)-TLR4信號通路，從而引起下游的腫瘤壞死因子等釋放減少有關(guān)；李悅妍等[14]通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿托伐他汀能夠改善動脈粥樣硬化程度，可能與下調(diào)TLR4表達(dá)引起單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)等炎性因子的表達(dá)有關(guān)，且TLR4蛋白表達(dá)水平與他汀類藥物的劑量有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)辛伐他汀干預(yù)后，大鼠肺血管形態(tài)有改善，且周圍的炎癥滲出減輕，檢測到TLR4蛋白表達(dá)水平下降，PCR結(jié)果證實(shí)TLR4 mRNA表達(dá)水平在辛伐他汀干預(yù)后明顯下降，與血管重塑程度呈正相關(guān)，初步提示辛伐他汀有抑制TLR4蛋白表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)的作用。而我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TLR4/NF-κB參與血管平滑肌增殖，誘導(dǎo)血管重塑，因此初步推測辛伐他汀對血管重塑的改善作用可能與TLR4/NF-κB活化被抑制、炎癥反應(yīng)被有效減輕有關(guān)。

綜上所述，辛伐他汀在煙霧暴露后的大鼠肺血管重塑中能夠有效改善血管炎癥反應(yīng)，減輕血管重塑，其機(jī)制可能與引起TLR4蛋白表達(dá)水平下降有關(guān)。而辛伐他汀影響TLR4下游哪些炎癥因子的表達(dá)及是否還有其他的作用途徑還需進(jìn)一步研究證實(shí)。