陳 杰 楊曉霞 余 汁

動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans, ASO)是由動脈粥樣硬化引起的缺血性疾病，其組織特征包括動脈內(nèi)膜增厚、鈣化和動脈管腔閉塞狹窄等[1, 2]。據(jù)報道，當(dāng)前全世界約有2億例ASO患者，其中，75歲以上人群的發(fā)生率高達(dá)20%[3, 4]。目前，已有大量研究探討了ASO的潛在病理機(jī)制，涉及炎性反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖遷移及血栓形成等，其中以VSMCs的異常增殖和遷移最為重要[5, 6]。作為血管壁的主要成分，VSMCs生物學(xué)功能的異常和表型轉(zhuǎn)換可促進(jìn)動脈粥樣硬化、高血壓和術(shù)后血管狹窄等血管疾病的發(fā)生，從而影響患者的生存質(zhì)量[7, 8]。

利伐沙班是一種直接FⅩa因子抑制劑，相對分子質(zhì)量較小(436g/mol)，可與血漿蛋白高度結(jié)合(結(jié)合率約為92%～95%)，具有口服便捷、見效快和高安全性等優(yōu)點(diǎn)，故被廣泛用于治療冠狀動脈疾病、術(shù)后靜脈血栓和腦卒中等[9, 10]。利伐沙班的作用機(jī)制是濃度依賴性地抑制與凝血相關(guān)的FⅩa、與凝血酶原結(jié)合的FⅩa和游離FⅩa，但其對由凝血酶、膠原蛋白和二磷酸腺苷引起的血小板聚集無直接影響[9]。據(jù)報道，利伐沙班不僅能抑制血栓形成，減輕動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展和失穩(wěn)，還能增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活力和遷移，并保護(hù)這些細(xì)胞免受FⅩa因子的促炎作用[11, 12]。而關(guān)于利伐沙班對血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用目前尚無研究闡明，本研究旨在探討利伐沙班對PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的影響。

材料與方法

1.材料：人主動脈血管平滑肌細(xì)胞株(HAVSMC)購自美國ATCC公司；利伐沙班(美國Sigma公司)；Edu染色試劑盒(中國廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；FBS、PDGF-BB、抗N-cadherin、抗E-cadherin、抗GAPDH和兔抗IgG(中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液和MTT試劑盒(中國北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)； ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國上海翊圣生物科技有限公司)；PI/RNase染色液(美國Cell Signaling Technology公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將HAVSMCs接種于含1%細(xì)胞生長因子、2%FBS、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80%時，用胰蛋白酶進(jìn)行消化和傳代，并選擇3～7代處于對數(shù)期的穩(wěn)定細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞分組及處理：將HAVSMCs分成3組，即對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB+利伐沙班組。待HAVSMCs細(xì)胞貼壁后，替換成無血清DMEM培養(yǎng)基孵育24h，使得HAVSMCs同步化。再給予20ng/ml PDGF-BB刺激HAVSMC細(xì)胞48h，以模擬ASO產(chǎn)生條件，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖遷移。在此基礎(chǔ)上，再用溶于DMSO的8μm利伐沙班與PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs細(xì)胞共孵育24h。

4.MTT法檢測各組HAVSMCs細(xì)胞活力：將HAVSMCs接種于96孔板，密度為5×104個/孔，而后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按照材料與方法2進(jìn)行不同細(xì)胞處理，離心并吸棄上清液，加20μl 5mg/ml MTT溶液反應(yīng)3～4h。再加150μl DMSO試劑，振蕩10min致使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測570nm處的吸光度A值。

5.Edu染色法檢測各組HAVSMCs增殖活性：將HAVSMCs接種于96孔板，密度為5×104個/孔，放入5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。按照材料與方法2進(jìn)行不同細(xì)胞處理，參考Edu染色試劑盒說明書，室溫下在孔板中加50nmol/l Edu溶液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2h，加4%甲醛固定0.5h。而后，加入1000μl Edu Apollo處理細(xì)胞0.5h，DAPI核染色0.5h。用倒置顯微鏡(×100)觀察染色情況，即時拍照。

6.流式細(xì)胞儀檢測各組HAVSMCs細(xì)胞周期：分別轉(zhuǎn)移1×106個對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB+利伐沙班組的血管平滑肌細(xì)胞至流式管中，并用預(yù)冷PBS清洗2次。流式管經(jīng)1100r/min離心后棄去上清，加5ml 75%乙醇，振蕩混勻，并于4℃避光孵育過夜。1200r/min離心10min，小心移除上清。隨后依次加入PBS和PI/RNase染色液，繼續(xù)孵育12min，并在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測G0/G1期、S期及G2/M期的細(xì)胞占比。

7.Transwell檢測各組HAVSMCs遷移能力：收集對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB+利伐沙班組的血管平滑肌細(xì)胞，將其懸浮于無血清培養(yǎng)基中，并稀釋細(xì)胞懸液至2×106個/毫升。在Transwell小室的上腔室中加100μl細(xì)胞懸液，同時，下腔室中加500μl無血清DMEM培養(yǎng)基。37℃孵育24h后，用4%多聚甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色。最后，用倒置顯微鏡(×100)觀察細(xì)胞遷移數(shù)并成像。

8.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組HAVSMCs劃痕愈合能力：收集對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB+利伐沙班組的血管平滑肌細(xì)胞，將其接種于6孔板中，密度為1×105個/孔。待細(xì)胞貼壁后，再用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。用20μl移液槍槍頭在孔板上劃線，同時用PBS清洗細(xì)胞2次。重新添加培養(yǎng)液，將孔板培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，并于顯微鏡下(×40)觀察0和24h的劃痕變化及拍照。

9.Western blot法檢測血管平滑肌細(xì)胞N-cadherin和E-cadherin蛋白表達(dá)：收集對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB+利伐沙班組的血管平滑肌細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加5%脫脂牛奶室溫封閉膜2h。用PBST溶液漂洗PVDF膜5次，加入一抗并在4℃下孵育過夜：抗N-cadherin、抗E-cadherin(稀釋比為1∶1000)和抗GAPDH(稀釋比為1∶2000)。再次用PBST溶液漂洗，加入兔抗IgG(稀釋比為1∶2000)孵育1h。以GAPDH為內(nèi)參，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測并分析各組目的蛋白表達(dá)量。

結(jié) 果

1.利伐沙班抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖：MTT及Edu實(shí)驗(yàn)顯示，與陰性對照組比較，PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞活力明顯升高(P<0.01)；與PDGF-BB組比較，利伐沙班處理顯著抑制了PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的活力(P<0.05，圖1)。

圖1 利伐沙班抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖A.MTT法檢測各組HAVSMCs細(xì)胞活力；B.Edu染色觀察各組HAVSMCs增殖情況(×100)；*P<0.05，**P<0.01

2.利伐沙班抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞從G0/G1期到S期轉(zhuǎn)換：PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs中S期細(xì)胞數(shù)量較陰性對照組顯著增加，且G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降；與PDGF-BB組比較，利伐沙班處理后，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，即利伐沙班抑制了PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMC從G0/G1期到S期的細(xì)胞進(jìn)程(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期

3.利伐沙班抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移：與陰性對照組比較，PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)；與PDGF-BB組比較，利伐沙班處理能顯著降低PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMC的遷移能力，即利伐沙班在體外能有效抑制動脈硬化閉塞癥模型細(xì)胞的遷移能力(圖3)。

圖3 利伐沙班抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移A.Transwell檢測各組HAVSMCs的遷移能力(結(jié)晶紫染色，×100)；B.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組HAVSMCs中劃痕愈合情況(×40)

4.利伐沙班調(diào)控PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移蛋白表達(dá)：與陰性對照組比較，PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs中促遷移蛋白N-cadherin的表達(dá)量明顯增加，但抑遷移蛋白E-cadherin表達(dá)量明顯減少；與PDGF-BB組比較，利伐沙班處理PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs后，N-cadherin表達(dá)量顯著減少，E-cadherin表達(dá)量顯著增加(圖4)。

圖4 Western blot法檢測各組HAVSMCs中遷移相關(guān)蛋白N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)量

討 論

動脈硬化閉塞癥是最常見的外周血管疾病之一，與高血壓、年齡、慢性腎衰竭和糖尿病等高風(fēng)險因素有關(guān)，可影響下肢動脈、冠狀動脈和大腦動脈，且下肢動脈硬化閉塞癥會增加靜息疼痛、壞疽和跛行的風(fēng)險[1,13,14]。在動脈硬化閉塞癥的發(fā)生、發(fā)展過程中，脂質(zhì)會持續(xù)沉積在動脈內(nèi)膜上，促使其惡化增生，形成動脈粥樣斑塊[1]。且隨著動脈壁的增厚和扭曲，斑塊面積也會不斷擴(kuò)大，繼而誘發(fā)血栓形成及缺血癥狀[15,16]。由于社會人口老齡化以及不健康的高脂飲食，動脈硬化閉塞癥的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，現(xiàn)已引起廣泛關(guān)注。

動脈硬化閉塞癥的病理機(jī)制涉及血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖遷移、炎性反應(yīng)激活和動靜脈血栓形成等，通常會導(dǎo)致患者機(jī)體供血不足，甚至危及其性命[6]。其中，血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖遷移會致使血管腔狹小和管壁內(nèi)膜增厚[17]，加速動脈硬化閉塞癥的發(fā)病進(jìn)程。據(jù)報道，miR-22-3p和miR-4463均可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移和內(nèi)膜增生，從而調(diào)控動脈硬化閉塞癥的病理進(jìn)程[18,19]。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，筆者最終選用PDGF-BB刺激HAVSMCs，模擬動脈硬化閉塞癥的產(chǎn)生條件，以構(gòu)建體外細(xì)胞模型[5]。筆者研究表明，PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs細(xì)胞活力顯著升高，且S期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，處于活躍增殖狀態(tài)。此外，HAVSMCs遷移能力明顯增強(qiáng)，伴隨著N-cadherin蛋白表達(dá)量上升，E-cadherin蛋白表達(dá)量下降，即PDGF-BB刺激處理促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖遷移。

迄今為止，動脈硬化閉塞癥的診斷有了很大的提高，但其有效治療措施仍然有限。目前動脈硬化閉塞癥的治療方式主要有開放性手術(shù)治療、藥物治療及干細(xì)胞移植等。前者包括血管搭橋術(shù)、血管內(nèi)治療和動脈內(nèi)膜切除術(shù)，但存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高和僅有30%患者適用等弊端[4]。后者包括溶栓藥、抗凝藥、抗血小板藥和血管擴(kuò)張素等，但此類藥物通常需要長期服用并存在各種毒性不良反應(yīng)，如消化道出血、頭痛等[20]。因此，篩選并采用不良反應(yīng)小和低毒的新型抗凝藥物有助于更好地治療動脈硬化閉塞癥患者。

利伐沙班作為全球第1個獲得臨床使用授權(quán)的新型口服抗凝藥物，具有不良反應(yīng)小、易吸收、抗血栓和抗炎功效，常被用于預(yù)防房顫血栓栓塞并發(fā)癥、肺栓塞形成及術(shù)后靜脈血栓栓塞形成[21～23]。據(jù)報道，利伐沙班可通過抑制FⅩa因子調(diào)控巨噬細(xì)胞和大鼠血管平滑肌細(xì)胞的炎癥激活，從而減輕血管損傷后新生內(nèi)膜的形成[24]。為了明確利伐沙班治療動脈硬化閉塞癥的藥理作用，筆者研究用8μm利伐沙班處理PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利伐沙班有效抑制了PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs的細(xì)胞活力并抑制其由G0/G1期到S期，表現(xiàn)為S期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。同時，利伐沙班處理PDGF-BB誘導(dǎo)的HAVSMCs后，血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力也有所減弱，N-cadherin蛋白表達(dá)量減少，E-cadherin蛋白表達(dá)量增加，即利伐沙班能有效減弱血管平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移能力，從而緩解動脈硬化閉塞癥的發(fā)病癥狀。

綜上所述，利伐沙班能有效抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，為動脈硬化閉塞癥的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。