李建州 李曉青 楊 英 李蘭娟

肝衰竭病情危重，病死率高，常規(guī)內(nèi)科治療效果很不理想[1,2]。人工肝支持系統(tǒng)是目前臨床治療肝衰竭的最重要手段之一，而以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物人工肝(bioartificial liver，BAL)由于結(jié)構(gòu)和功能更接近正常肝臟，完全替代肝臟的合成、代謝解毒等功能，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，有望為肝衰竭的臨床治療提供新的途徑[3,4]。

目前國(guó)外已有多個(gè)BAL系統(tǒng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但達(dá)到真正的大規(guī)模臨床應(yīng)用仍有很多問(wèn)題需要解決，其中最關(guān)鍵的是如何獲得足夠數(shù)量、高活性且功能良好的肝細(xì)胞[5,6]。本研究以Huh7細(xì)胞、永生化人源性HepLi3細(xì)胞為研究對(duì)象，以C3A細(xì)胞為對(duì)照，比較3種細(xì)胞的增殖能力及合成、代謝功能，評(píng)估其作為生物人工肝細(xì)胞源的潛力。

材料與方法

1.細(xì)胞系及主要試劑：C3A細(xì)胞系和Huh7細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；HepLi3細(xì)胞系由傳染病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立并提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；白蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bethyl Laboratories公司；尿素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioAssay System公司；CYP3A4檢測(cè)試劑盒、CYP1A2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa生物株式會(huì)社；CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4一抗抗體購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；熒光二抗購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)：3種肝細(xì)胞均用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將3種細(xì)胞以每孔2000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，各設(shè)置3個(gè)副孔，分別在第0、24、48、72h進(jìn)行MTT檢測(cè)。在各孔加入10μl的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4h，加入溶解液后孵育過(guò)夜，用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)595nm波長(zhǎng)下的吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線。

3.熒光定量PCR分析：在同樣的培養(yǎng)條件下，用胰酶消化細(xì)胞，離心獲取細(xì)胞，采用Trizol法提取3種肝細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析。PCR引物詳見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

4.免疫熒光蛋白分析：用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20min，PBS洗滌后用0.25% TritonX-100室溫處理細(xì)胞30min，PBS洗滌后用2.5% BSA封閉1h，稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌后用稀釋的二抗避光孵育60min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下拍照，目標(biāo)蛋白顯示為胞質(zhì)的綠色熒光，細(xì)胞核為紅色熒光，用Image J軟件進(jìn)行熒光吸光度分析。

5.肝細(xì)胞合成與代謝功能的檢測(cè)：將3種細(xì)胞接種于12孔板上，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，適應(yīng)性培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，留取上清按試劑盒說(shuō)明書分別進(jìn)行白蛋白、尿素含量的檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書采用熒光底物法分別進(jìn)行CYP1A2、CYP3A4代謝活性的檢測(cè)，最終結(jié)果以培養(yǎng)孔細(xì)胞總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

6.肝衰竭血漿對(duì)3種肝細(xì)胞活性的影響：取筆者醫(yī)院住院乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血漿置換時(shí)分離的血漿(相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)如下：總膽紅素388μmol/L，直接膽紅素膽紅素320μmol/L，凝血酶原活動(dòng)度25%，血氨106μmol/L，HBV-DNA 3.85E+007IU/ml)，將3種細(xì)胞以每孔2000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，各設(shè)置3個(gè)副孔，培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基為肝衰竭血漿，以正常培養(yǎng)基為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

結(jié) 果

1.3種肝細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)曲線：3種肝細(xì)胞形態(tài)雖略有不同，但均呈多邊形或不規(guī)則形，邊界清楚，細(xì)胞核較大，核膜清楚，胞質(zhì)豐富，與正常肝細(xì)胞類似。3種肝細(xì)胞均具有良好的增殖能力，生長(zhǎng)曲線均呈S型，24～48h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在24h后，HepLi3細(xì)胞的增殖能力明顯強(qiáng)于C3A細(xì)胞和Huh7細(xì)胞(P<0.05，圖1)。

圖1 3種肝細(xì)胞的形態(tài)(×200)及生長(zhǎng)曲線A.C3A細(xì)胞；B.Huh7細(xì)胞；C.HepLi3細(xì)胞；D.3種肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;與C3A細(xì)胞比較，*P<0.05；與Huh7細(xì)胞比較，#P<0.05

2.3種肝細(xì)胞的功能基因mRNA的表達(dá)：在mRNA表達(dá)層面，3種肝細(xì)胞比較，C3A細(xì)胞CYP2E1的表達(dá)水平最高(P<0.05)；Huh7細(xì)胞GST、CYP1A2、CYP3A4的表達(dá)水平最高，ALB的表達(dá)水平最低(P<0.05)；HepLi3細(xì)胞ALB、GST的表達(dá)水平與C3A細(xì)胞相當(dāng)，但CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4的表達(dá)水平最低(P<0.05，圖2)。

圖2 3種肝細(xì)胞功能基因mRNA的表達(dá)水平與C3A細(xì)胞比較，*P<0.05；與Huh7細(xì)胞比較，#P<0.05

3.3種肝細(xì)胞代謝功能基因蛋白的表達(dá)：在蛋白表達(dá)層面，3種肝細(xì)胞比較，C3A細(xì)胞CYP2E1的表達(dá)水平最高(P<0.05)；Huh7細(xì)胞CYP3A4的表達(dá)水平最高。HepLi3細(xì)胞CYP2E1、CYP3A4的表達(dá)水平與C3A細(xì)胞相當(dāng)；3種肝細(xì)胞CYP1A2的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 3種肝細(xì)胞功能基因蛋白的表達(dá)水平A.免疫熒光染色圖(×200)，目標(biāo)蛋白顯示為胞質(zhì)綠色熒光，細(xì)胞核紅色熒光；B.相對(duì)熒光強(qiáng)度值的比較；與C3A細(xì)胞比較，*P<0.05；與Huh7細(xì)胞比較，#P<0.05

4.3種肝細(xì)胞的合成及代謝功能的比較：3種肝細(xì)胞比較，C3A細(xì)胞白蛋白合成功能最強(qiáng)(P<0.05)；Huh7細(xì)胞的CYP1A2代謝活性最高；HepLi3細(xì)胞的CYP3A4代謝活性最高(P>0.05)；3種肝細(xì)胞尿素的合成功能比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 3種肝細(xì)胞的合成及代謝能力的比較A.白蛋白合成功能；B.尿素合成功能；C.CYP1A2代謝活性；D.CYP3A4代謝活性；與C3A細(xì)胞比較，*P<0.05；與Huh7細(xì)胞比較，#P<0.05

5.肝衰竭血漿對(duì)3種肝細(xì)胞活性的影響：在培養(yǎng)24h后，與培養(yǎng)基組比較，肝衰竭血漿組肝細(xì)胞的活性無(wú)明顯下降(P>0.05，圖5)。

圖5 肝衰竭血漿對(duì)3種肝細(xì)胞活性的影響

討 論

BAL發(fā)揮治療作用主要依賴于反應(yīng)器中的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞源是目前制約BAL研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。理想的肝細(xì)胞源應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①易于獲取且能夠體外培養(yǎng)條件下擴(kuò)增；②具有良好的正常人肝細(xì)胞生理功能；③具有良好的生物安全性。理論上，正常人原代肝細(xì)胞生理功能及安全性最好，但是肝臟來(lái)源短缺及原代肝細(xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期體外培養(yǎng)及增殖限制了其臨床應(yīng)用。為了尋找易于擴(kuò)增的高活性、功能良好的肝細(xì)胞源，國(guó)內(nèi)外研究者進(jìn)行了積極的探索，其中以人肝腫瘤源性C3A細(xì)胞研究最多，該細(xì)胞不僅具有較好的增殖能力，而且能夠較好地保持肝細(xì)胞合成及代謝、解毒功能[7～13]。以該細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外肝臟支持系統(tǒng)(extracorporeal liver assist device，ELAD)經(jīng)過(guò)多年的研發(fā)，已在歐美多個(gè)國(guó)家開(kāi)展三期臨床試驗(yàn)，是目前最成功的BAL系統(tǒng)[14,15]。本研究選用的Huh7細(xì)胞也是一種人肝腫瘤源性細(xì)胞，目前在BAL研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。李蘭娟團(tuán)隊(duì)前期應(yīng)用SV40大T抗原基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染原代人肝細(xì)胞，成功構(gòu)建了多株永生化人源性肝細(xì)胞系，既保持了人肝細(xì)胞的生物特性和功能，且增殖能力強(qiáng)，為BAL提供了更多的細(xì)胞源選擇[16]。本研究選用的HepLi3細(xì)胞為其中的一株細(xì)胞系。

本研究通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，3種肝細(xì)胞在常規(guī)的培養(yǎng)條件下均具有良好的增殖能力，72h能夠擴(kuò)增3～4倍。其中HepLi3的增殖能力優(yōu)于C3A細(xì)胞、Huh7細(xì)胞，更加適合大規(guī)模培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)為BAL治療提供足夠數(shù)量的肝細(xì)胞。在功能基因的表達(dá)上，本研究從mRNA、蛋白表達(dá)兩個(gè)層面進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示白蛋白合成及多種細(xì)胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)家族相關(guān)基因在3種肝細(xì)胞中均有一定程度的表達(dá)。雖然部分基因的表達(dá)差異與功能的差異并不完全一致，但也在一定層面體現(xiàn)了3種細(xì)胞部分保持了肝細(xì)胞原有的生物學(xué)特性。在功能評(píng)估上，本研究發(fā)現(xiàn)C3A細(xì)胞的白蛋白合成能力最好，這與既往的研究報(bào)道一致。而Huh7細(xì)胞的CYP1A2代謝活性最高，HepLi3細(xì)胞的CYP3A4代謝活性最高。

CYP450是主要分布于肝微粒體的藥物主要代謝酶，參與脂肪酸、類花生四烯酸等多種內(nèi)源性物質(zhì)及藥物、毒物、致癌物等外源性化合物的代謝，與肝臟的代謝解毒功能密切相關(guān)[17,18]。在臨床治療上，BAL的合成功能可以通過(guò)外源性補(bǔ)充白蛋白、血漿等來(lái)解決，代謝解毒功能才是BAL發(fā)揮作用的關(guān)鍵。本研究通過(guò)多個(gè)層面的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，Huh7細(xì)胞、HepLi3細(xì)胞在代謝解毒方面相較于C3A細(xì)胞可能更具優(yōu)勢(shì)，但還需要進(jìn)一步系統(tǒng)全面的評(píng)估。

肝衰竭患者體內(nèi)存在大量毒性物質(zhì)積聚，可能會(huì)在BAL治療過(guò)程對(duì)反應(yīng)器中肝細(xì)胞活性產(chǎn)生不利影響[19]。本研究發(fā)現(xiàn)在肝衰竭血漿中培養(yǎng)24h后，3種肝細(xì)胞的活性均沒(méi)有顯著下降，為其功能發(fā)揮提供的基本保證。綜上所述，Huh7細(xì)胞、HepLi3細(xì)胞具有良好的增殖能力及合成、代謝功能，有望為BAL提供良好的細(xì)胞源。