殷 銘 江 洪

蒽環(huán)類化療藥(anthracyclines，ANT)是一類抗有絲分裂的細(xì)胞毒性藥物，具體有阿霉素、柔紅霉素、表柔比星等。ANT是乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌等惡性腫瘤疾病的經(jīng)典用藥。在使用過程中，ANT能隨累積劑量的增多而加重心臟損傷，這種毒性在治療后的短時(shí)間內(nèi)就能發(fā)生，可以導(dǎo)致心律失常、心肌損傷、心力衰竭等不良反應(yīng)[1,2]。在對涉及阿霉素治療的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，累積劑量為400、500和550mg/m2的實(shí)驗(yàn)組中分別有5%、16%和26%的患者發(fā)生了阿霉素介導(dǎo)的心臟損傷[3]。在ANT誘導(dǎo)的心臟損傷中，QT間期延長、心率減慢、心律失常等心電圖表現(xiàn)比較常見，并且可能引起尖端扭轉(zhuǎn)室速、心室顫動(dòng)等危及生命的后果[4]。本研究旨在為阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷和心電活動(dòng)紊亂的基因和通路層面的機(jī)制探索提供新的方向。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)集的獲取與差異基因的篩選：通過分別設(shè)定檢索關(guān)鍵詞：[(anthracyclines OR doxorubicin) and cardiotoxicity]、[(ventricular arrhythmia) OR (myocardial Injury) OR (arrhythmic cardiomyopathy)]，檢索Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫，確定并獲取數(shù)據(jù)集信息后，使用GEO2R、R Studio和MicroSoft Excel對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選、差異計(jì)算和ID轉(zhuǎn)換，過濾出統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)P<0.05，fold change(FC)>2的基因，并定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因(differentially expressed genes，DEGs)。根據(jù)探針信息轉(zhuǎn)換Gene ID，同時(shí)根據(jù)log2(FC)值大小進(jìn)行排序，以刪除多個(gè)探針的重復(fù)基因。篩選參數(shù)log2(FC)>1為上調(diào)基因，log2(FC)<-1為下調(diào)基因，分別得到數(shù)據(jù)集中具有差異表達(dá)的上調(diào)基因和下調(diào)基因。隨后，使用Venny(版本2.1)對數(shù)據(jù)集共同具有的上調(diào)基因和下調(diào)基因進(jìn)行層次聚類，獲取共差異表達(dá)上調(diào)基因(up-DEGs)和共差異表達(dá)下調(diào)基因(down-DEGs)。

2.功能富集分析：在分別獲取up-DEGs和down-DEGs后，為了探究這些基因可能存在的細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程和信號(hào)通路，使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體論(GO)注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)途徑分析[5]。在DAVID數(shù)據(jù)庫中分別輸入上述up-DEGs和down-DEGs，物種為homo sapiens，GO功能注釋富集分析選擇分子功能(MF DIRECT)、生物學(xué)過程(BP DIRECT)、細(xì)胞成分(CC DIRECT)。通路富集分析選擇KEGG Pathway，導(dǎo)出差異文件至MicroSoft Excel(版本2016)中并設(shè)置統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)P<0.05，F(xiàn)old change>2視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以確定上述基因涉及的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。

3.PPI網(wǎng)絡(luò)分析：為探討差異基因及其對應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用，將獲取得到的up-DEGs和down-DEGs在STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行映射，設(shè)置蛋白互作最低分?jǐn)?shù)>0.4以獲取具有顯著互作關(guān)聯(lián)的DEGs。隨后在Java 1.8.0-162的配置文件下使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行功能聚類、結(jié)點(diǎn)層級(jí)排序和比對，使用cytoHubba插件和MCODE插件對相互作用最高的功能模塊進(jìn)行篩選，同時(shí)確定為關(guān)鍵基因(hub基因)，并對hub基因進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析[5]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.獲取得到相同表達(dá)趨勢上調(diào)基因和下調(diào)基因：通過查看數(shù)據(jù)集簡介和信息，確定數(shù)據(jù)集GSE106297和GSE29819。數(shù)據(jù)集GSE106297使用GPL11154(Illumina HiSeq 2000)平臺(tái)，對使用阿霉素(Dox組)或?qū)φ仗幚?Con組)的人胚胎干細(xì)胞來源心肌細(xì)胞進(jìn)行高通量測序以獲取表達(dá)譜信息[6]。數(shù)據(jù)集GSE29819使用GPL570 (Affymetrix U133 Array)平臺(tái)，對心律失常合并心肌損傷(VAs組)和正常對照(Con組)的人類心肌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組矩陣分析以獲取表達(dá)譜信息[7]。在GSE106297獲得上調(diào)基因522個(gè)、下調(diào)基因6992個(gè)(圖1A)。在GSE29819中獲得上調(diào)基因832個(gè)、下調(diào)基因819個(gè)(圖1B)。分別對上調(diào)基因和下調(diào)基因做層次聚類，其中確定27個(gè)基因在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均上調(diào)，312個(gè)基因在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均下調(diào)(圖1中C、D)。

2.GO注釋富集分析:使用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對up-DEGs和down-DEGs進(jìn)行潛在功能和途徑分析。其中up-DEGs涉及的生物學(xué)過程主要有蛋白水解、細(xì)胞外基質(zhì)的組織形成、細(xì)胞增殖調(diào)控、炎性反應(yīng)、凝血、內(nèi)肽酶活性的負(fù)向調(diào)節(jié)等。up-DEGs涉及的細(xì)胞組分包括細(xì)胞外泌體、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)等部位。up-DEGs涉及的分子功能包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、整聯(lián)蛋白組合、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑的活性調(diào)節(jié)。down-DEGs涉及的生物學(xué)過程主要有細(xì)胞增殖和基因表達(dá)調(diào)控、冠狀動(dòng)脈血管發(fā)育、血管平滑肌細(xì)胞增殖、心內(nèi)膜形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、BMP信號(hào)途徑相關(guān)心臟誘導(dǎo)、p53類介體相關(guān)信號(hào)、 GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、磷酸酶活性、細(xì)胞周期調(diào)控、突觸信息傳遞等。down-DEGs涉及的細(xì)胞組分包括中心體、神經(jīng)細(xì)胞體、突觸后膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)。down-DEGs涉及的分子功能包括序列特異性DNA結(jié)合、翻譯起始因子結(jié)合、R-SMAD結(jié)合、細(xì)胞骨架銜接因子活性、PDZ域結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、DNA結(jié)合、連接酶活性、金屬離子結(jié)合、核酸結(jié)合等。

3.KEGG通路富集分析:《京都基因與基因組百科全書》(KEGG)途徑的富集表達(dá)已經(jīng)被KAAS定義并公布。使用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對up-DEGs和down-DEGs進(jìn)行KEGG Pathway分析。結(jié)果顯示，up-DEGs涉及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。down-DEGs涉及癌癥途徑、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、FoxO信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、基底細(xì)胞癌、干細(xì)胞多能性調(diào)節(jié)相關(guān)通路。

4.PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub基因篩選：PPI網(wǎng)絡(luò)用于將所有蛋白質(zhì)編碼基因組織成一個(gè)大型網(wǎng)絡(luò)，從而可以更好地了解蛋白質(zhì)組的功能組織。使用STRING數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行up-DEGs和down-DEGs的PPI交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中up-DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中擁有27個(gè)節(jié)點(diǎn)和8對蛋白質(zhì)交互作用連線(圖2A)，down-DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中擁有311個(gè)節(jié)點(diǎn)和378對蛋白質(zhì)交互作用連線(圖2B)。導(dǎo)出交互數(shù)據(jù)至CytoScape，通過CytoHubba篩選重要功能模塊，并確定hub基因(圖2中C、D)。

圖2 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因篩選A.上調(diào)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；B.下調(diào)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；C.上調(diào)hub基因；D.下調(diào)hub基因

5.hub基因功能注釋和通路富集分析：up-DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，hub基因涉及的蛋白質(zhì)有α1-抗胰蛋白酶、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、骨橋蛋白、組織因子途徑抑制蛋白、TGF-β誘導(dǎo)蛋白、膠原蛋白α1鏈、尿激酶型纖溶酶原激活蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，涉及的生物學(xué)過程主要包含IGFBP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、生長因子結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和蛋白結(jié)合等，涉及的KEGG通路包含補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、ECM受體交互、局限性粘連、人乳頭瘤病毒感染和PI3K-Akt信號(hào)通路。down-DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，hub基因涉及的蛋白質(zhì)有E3泛素蛋白連接酶、鋅指蛋白、F-box/LRR重復(fù)序列蛋白、F-box/WD重復(fù)序列蛋白，涉及的生物學(xué)過程主要包含蛋白質(zhì)自體泛素化、蛋白質(zhì)多泛素化、蛋白質(zhì)定位細(xì)胞核、泛素依賴性蛋白分解過程、翻譯后蛋白質(zhì)修飾和蛋白水解，涉及的KEGG通路包含泛素介導(dǎo)的蛋白水解。

討 論

蒽環(huán)類藥物是用于治療淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤的主要化療藥物之一，但同時(shí)它也是對心臟毒性最大的藥物之一，ANT誘發(fā)的心臟損傷可以表現(xiàn)為室性心律失常(ventricular arrhythmias，VAs)、心力衰竭、心肌損傷等，盡管已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)十年的探索，但其心臟毒性機(jī)制還不是很明確[8]。心臟是阿霉素毒性不良反應(yīng)的主要靶器官，但由于人的心臟組織標(biāo)本在很大程度上無法被獲取，在體外也無法進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)藥物對不同種屬間存在差異，因此動(dòng)物模型無法準(zhǔn)確概括阿霉素致心臟損傷的機(jī)制，特別是在心臟電生理和收縮性功能。因此，Maillet等[6]在GSE106297數(shù)據(jù)集中使用了人多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞，它可表達(dá)人類心臟離子通道和肌節(jié)蛋白，具有很高的人體心臟生理學(xué)相關(guān)性，所以成為研究心臟疾病建模和藥物篩選的強(qiáng)大工具。心肌損傷合并心律失常的數(shù)據(jù)集GSE29819則選用Gaertner等[7]進(jìn)行的臨床研究，他們通過收集心律失常心肌病的心臟組織、擴(kuò)張性心肌病的心臟組織和正常心肌組織，確定了不同疾病、不同心室之間基因表達(dá)差異情況。

本研究發(fā)現(xiàn)的差異基因可能在阿霉素致心臟損傷合并心電信號(hào)紊亂、心律失常的患者中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，TGFBI基因是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)基因，它能夠組成TGFBI- TGF信號(hào)通路并調(diào)節(jié)組織分化、細(xì)胞增殖，在胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被顯著激活[9]。而在心律失常的研究中則發(fā)現(xiàn)，TGF-β的高表達(dá)被認(rèn)為可能與心肌缺血后VAs的發(fā)生以及心房顫動(dòng)患者的心肌纖維化顯著相關(guān)[10]。SPP1基因能參與基質(zhì)的形成和降解，在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的急性淋巴細(xì)胞白血病、髓母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤中的持續(xù)高表達(dá)存在，可能與遠(yuǎn)期生存時(shí)間縮短顯著相關(guān)[11]。與此同時(shí)，SPP1基因被觀察到能引起肌肉組織和其他結(jié)締組織的纖維化，并能夠調(diào)節(jié)炎癥對肌肉組織的損傷，介導(dǎo)其再生以及纖維化，這可能與心房顫動(dòng)和心肌梗死后瘢痕增生致室性心律失常有關(guān)[12,13]。

CXCL基因家族與炎性趨化因子密切相關(guān)，它能影響成纖維、巨噬、肥大等細(xì)胞、血管系統(tǒng)細(xì)胞在內(nèi)多種基質(zhì)細(xì)胞的增生和遷移，由此改變腫瘤微環(huán)境以促進(jìn)癌癥進(jìn)展[14]。另有研究顯示，在慢性心臟損傷模型中，CXCL基因介導(dǎo)心肌缺血壞死后以中性粒細(xì)胞為主、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞為輔的炎性反應(yīng)，參與梗死后瘢痕組織纖維化形成[15]。GNAS基因能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控刺激性G蛋白α亞基(Gsα)，進(jìn)而調(diào)節(jié)第二信使環(huán)磷酸腺苷參與改變的多種激素和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，并證明與垂體瘤、胰腺腺癌、腎透明細(xì)胞癌、肝癌等惡性腫瘤有關(guān)[16]。歐洲一項(xiàng)針對1223例患者的前瞻性多中心臨床研究中證實(shí)，GNAS的高表達(dá)與室性心動(dòng)過速顯著相關(guān)，并且指出這可能是由于交感神經(jīng)激活受到G蛋白偶聯(lián)受體家族之一的β腎上腺素受體的正向調(diào)控，從而增加了心臟對β-腎上腺素能刺激的反應(yīng)[17]。

對這些差異基因進(jìn)行生物學(xué)功能富集分析，在心肌梗死后VAs的產(chǎn)生中，炎性反應(yīng)占據(jù)了重要地位，這是因?yàn)檠仔苑磻?yīng)及其CRP、IL-6、IL-1β等炎性介質(zhì)能夠引起心室電重構(gòu)，包括心肌膜電位的波動(dòng)、心臟離子通道表達(dá)的改變和單相動(dòng)作電位的延長。它還會(huì)導(dǎo)致更高的心室電活動(dòng)易損性和觸發(fā)活動(dòng)，從而導(dǎo)致更高的室性心律失常誘發(fā)率[18]。在心房顫動(dòng)的發(fā)生和維持中，炎性反應(yīng)可以改變心房電生理和結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致心房顫動(dòng)易感性增加，具體還能通過調(diào)節(jié)心肌鈣穩(wěn)態(tài)和連接蛋白，改變心房電活動(dòng)傳導(dǎo)的觸發(fā)因素。另外，炎性反應(yīng)能通過成纖維細(xì)胞、TGF-β等激活纖維化途徑，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)心房的電重塑和結(jié)構(gòu)重塑[19]。

在對基因下游對應(yīng)的蛋白質(zhì)互相作用分析方面，IGF-PI3K-Akt信號(hào)通路在肥胖、糖尿病的心臟保護(hù)中起到重要功能，同時(shí)它還能調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡和遷移[20]。研究顯示，快室率心房顫動(dòng)能夠誘導(dǎo)PI3K-Akt信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而引起心房纖維化和有效不應(yīng)期延長，并能夠介導(dǎo)抗炎和抗氧化應(yīng)激作用發(fā)揮保護(hù)作用[21]。在缺血再灌注損傷模型中，PI3K-Akt信號(hào)通路活性下降能導(dǎo)致大鼠室性心律失常發(fā)生率明顯升高[22]。在涉及的KEGG通路中，鋅指蛋白是人轉(zhuǎn)錄因子中最龐大的一個(gè)集合，它可以通過與不同的受體結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、發(fā)育、自噬等生物學(xué)過程。除了參與不同細(xì)胞環(huán)境或刺激下的癌癥進(jìn)程外，鋅指蛋白也是參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大的轉(zhuǎn)錄因子之一，可以參與諸如交感神經(jīng)和RAAS的刺激、蛋白質(zhì)相互作用的改變[23]。有研究顯示，在心力衰竭的發(fā)展和惡化過程中，鋅指蛋白GATA4與內(nèi)源性組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶可以促進(jìn)心肌纖維化和心肌肥大，通過使用該通路抑制劑則可以改善心力衰竭的病程。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素可能通過上調(diào)或下調(diào)多個(gè)基因影響相關(guān)通路，進(jìn)而改變相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而引起心臟損傷和心電信號(hào)紊亂，這可能加重心律失常的發(fā)生。