陳旭昕 唐 儉 李虎明 孟激光 韓志海

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)是一種具有自我更新和多向分化潛能的多功能干細胞[1]。研究表明，輸入外源性或遷移的內(nèi)源性干細胞能定植在損傷的肺組織內(nèi)，分化為多種肺細胞，參與受損肺組織的修復與重構(gòu)，可治療急性肺損傷、肺纖維化和慢性阻塞性肺疾病[2, 3]。但是在疾病狀態(tài)下，機體處于缺血缺氧、氧化應激、休克、炎癥爆發(fā)的環(huán)境中，移植到損傷部位的MSC由于不適應惡劣的體內(nèi)環(huán)境，約90%以上會死亡，大大降低了MSC在損傷修復中的療效[4]。血紅素加氧酶(heme oxygenase, HO)是一種細胞微粒體酶，參與細胞保護、凋亡和炎癥[5]。已有研究表明，經(jīng)血紅素加氧酶-1(HO-1)修飾后的MSC耐受缺氧復氧損傷能力顯著增強，并提高了MSC對受損心肌的修復能力[6]。但HO-1基因修飾增強MSCs缺氧耐受的同時是否會對MSC的“干性”特征造成影響尚缺乏直接證據(jù)證實，有待于進一步實驗研究證實。因此，本研究擬以大鼠BM-MSC為研究對象，以重組慢病毒載體為介導，構(gòu)建過表達大鼠HO-1基因的MSC，比較原代MSC與MSC-HO-1的增殖生長活性、免疫表型及多向分化能力的變化，以期為后續(xù)研究奠定基礎。

材料與方法

1.材料：SPF級Wistar大鼠(3～4周齡，體質(zhì)量為100～120g)由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。重組慢病毒載體Lenti-GFP-HO-1(Lenti-HO-1)及空慢病毒載體(Lenti-GFP)均購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清均購自美國Gibco公司?？箁at-HO-1多克隆抗體、抗β-actin及二抗購自美國Santa Cruz公司?？捡R斯亮藍蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒及總蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。成骨、成脂及成軟骨誘導培養(yǎng)基均購自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司。藻紅蛋白(PE)標記的抗CD29、CD73、CD105、CD34和CD11b以及異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD90、CD45和CD14均購自英國Abcam公司。ECL-PLUS發(fā)光試劑盒及蛋白marker均購自美國Thermo Fisher公司。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

2.MSC分離培養(yǎng)：無菌條件下分離大鼠股骨，剪去股骨兩端，放入10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，反復用2ml無菌注射器沖洗骨髓腔，再用70nm尼龍網(wǎng)過濾后置于75cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2及 95%濕度條件下培養(yǎng)。隔天換液1次，去除非貼壁細胞，貼壁細胞為MSC。取傳代至2～3代細胞用于慢病毒轉(zhuǎn)染及MSC-HO-1構(gòu)建。實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

3.重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSC：將MSC接種于6孔板中，接種密度為1×106個/孔。共設置PBS組、空慢病毒載體(Lenti-GFP)組及重組慢病毒(Lenti-HO-1)組，待細胞融合度達70%～80%時，吸棄培養(yǎng)液，按分組分別在每孔中加入1ml PBS、Lenti-GFP或Lenti-HO-1(MOI=50)。12h后吸棄原培養(yǎng)液更換為DMEM完全培養(yǎng)基至終體積2ml繼續(xù)孵育96h，熒光倒置顯微鏡及Western blot法檢測慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。1.5μg/ml的嘌呤霉素加入到10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基中用于篩選具有嘌呤霉素抗性的MSC，即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Lenti-HO-1的MSC。

4.Western blot法檢測HO-1蛋白表達：收集轉(zhuǎn)染96h后的各組MSC和具有嘌呤霉素抗性第30代的MSC，按碧云天公司蛋白提取試劑盒說明書操作，提取細胞總蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后。以β-actin為內(nèi)參照，取25μl樣品依次行SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)過脫脂牛奶封閉后，依次加入一抗、二抗，ECL發(fā)光液中顯色。放入GBOX-HR凝膠成像分析系統(tǒng)中進行攝像分析。

5.MSC與MSC-HO-1生長曲線的測定：將第4代的MSC與MSC-HO-1按1×104個/孔接種至24孔板中，采用細胞計數(shù)法繪制兩細胞株生長曲線。

6.MSC與MSC-HO-1免疫表型檢測：采用流式細胞儀對MSC與MSC-HO-1表面標志分子進行檢測。收集第4代的MSC與MSC-HO-1，PBS洗滌細胞兩遍后用1%多聚甲醛固定30min，再次PBS洗滌細胞兩遍，用2% FBS+相應直標抗體(PE標記抗CD29、CD73、CD105、CD34和CD11b以及FITC標記的anti-CD90、anti-CD45和anti-CD14)在室溫下暗室中孵育1h，PBS清洗抗體，離心棄去上清，用500μl PBS重懸，置于流式專用管中上機檢測。

7.MSC與MSC-HO-1多向分化能力測定：收集第4代MSC與MSC-HO-1，接種于6孔板中，接種密度為1×106個/孔。待細胞融合度達60%時，吸棄原培養(yǎng)液，再加入成骨、成脂肪或成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2周后分別采用茜素紅染色、油紅染色及阿利新藍染色評估MSC與MSC-HO-1成骨、成脂肪及成軟骨染色情況。

結(jié) 果

1.Lenti-HO-1轉(zhuǎn)染MSC后轉(zhuǎn)染效率評估：重組慢病毒Lenti-HO-1按MOI=50感染MSC 96h后，分別在普通倒置光鏡下及熒光倒置顯微鏡下觀察，可以在熒光倒置顯微鏡下觀察到綠色熒光即存在GFP的表達。進一步提取細胞總蛋白，用Western blot法檢測MSC內(nèi)HO-1的表達以評估轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，與PBS組及Lenti-GFP組比較，Lenti-HO-1組中HO-1的表達被顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而Lenti-GFP組與PBS組比較，HO-1的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 Lenti-HO-1轉(zhuǎn)染效率的評估A.普通光鏡下觀察轉(zhuǎn)染后MSC(×100)；B.熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染MSC(×100)；C.Western blot法分析各組MSC中HO-1的表達。與Lenti-HO-1組比較，*P<0.05

2.MSC-HO-1內(nèi)HO-1蛋白表達檢測：Western blot法分析結(jié)果顯示，與第30代的MSC比較，第30代MSC-HO-1內(nèi)HO-1蛋白表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 第30代MSC及MSC-HO-1內(nèi)HO-1蛋白表達水平檢測

3.MSC與MSC-HO-1生長曲線的比較：采用細胞計數(shù)法比較MSC與MSC-HO-1的生長曲線變化，MSC-HO-1具有與MSC類似的增殖生長活性，生長曲線相似，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 MSC與MSC-HO-1生長曲線的比較

4.MSC與MSC-HO-1表型的比較：采用流式細胞儀對MSC與MSC-HO-1免疫表型進行檢測，MSC與MSC-HO-1一樣表達表面標志物CD29、CD90、CD73和CD105，但近乎不表達CD34、CD45、CD14和CD11b(圖4)。

圖4 MSC與MSC-HO-1免疫表型比較A.MSC表面標志的流式細胞儀檢測；B.MSC-HO-1表面標志的流式細胞儀檢測

5.MSC與MSC-HO-1多向分化能力的比較：分別采用茜素紅染色、油紅染色及阿利新藍染色評估MSC與MSC-HO-1多向分化能力。MSC與MSC-HO-1在相應誘導培養(yǎng)基的作用下，均可成功分化為骨、脂肪及軟骨(圖5)。

圖5 MSC與MSC-HO-1多向分化能力比較(×400)A、D.成骨分化(茜素紅染色)；B、E.成脂分化(油紅染色)；C、F.成軟骨分化(阿利新藍染色)

討 論

干細胞是近年來研究的熱點，以干細胞工程為代表的現(xiàn)代組織工程學為組織器官的修復與替代提供了一個嶄新的領域。MSC更新率低而代謝活力高，理論上可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其獲得外源目標基因并在體內(nèi)體外長期穩(wěn)定高效表達，是理想的基因治療載體細胞[7]。本研究結(jié)果表明，利用Lenti-HO-1可成功轉(zhuǎn)染MSC并對其實現(xiàn)基因修飾；與MSC比較，經(jīng)HO-1修飾的MSC(MSC-HO-1)在增殖生長活性、免疫表型及多向分化能力方面未發(fā)生顯著變化。

MSC是源于中胚層的成體干細胞的總稱，目前發(fā)現(xiàn)骨髓、脂肪、臍帶血中均存在自身MSC[8]。間充質(zhì)干細胞干性是指干細胞自我復制和分化能力[9]。MSC干性的維持依賴于細胞的自我更新，即在MSC非分化性增殖的同時抑制細胞的凋亡并保持其多向分化的潛能[10]。自我更新是指干細胞分裂產(chǎn)生至少1個具有干細胞特性子細胞的過程。分化潛能是指未分化的干細胞在一定條件下可分化為各種類型的細胞[11]。MSC的干性維持包括自我更新和分化潛能兩個方面，增殖和分化的平衡決定了MSC的最后歸宿[12]。在平衡狀態(tài)下，MSC可發(fā)育成脂肪、骨及軟骨或其他類型組織細胞，而在失衡狀態(tài)下則可能發(fā)生骨肉瘤及癌變等病變。在干細胞治療過程中干性的維持對治療效果起著決定性作用，干性特征的下降或丟失將影響治療效果[9, 13]。因此，在利用基因工程對MSC進行基因修飾時，并保持MSC的干性特征是十分重要的。研究表明，HO-1在MSC的免疫調(diào)控中起著重要作用，抑制HO-1會逆轉(zhuǎn)MSC的抗排異作用[14]。而上調(diào)HO-1表達則可改善MSC的缺氧耐受能力[5]。

本研究利用Lenti-HO-1成功構(gòu)建了過表達HO-1的間充質(zhì)干細胞，即MSC-HO-1。通過對MSC多向分化潛能的檢測，結(jié)果顯示，與MSC比較，MSC-HO-1同樣具有向骨、軟骨、脂肪多個胚層分化的能力，在相應誘導培養(yǎng)基的作用下，依然可成功分化為骨、脂肪及軟骨組織。此外，筆者還比較了MSC-HO-1與MSC的生長曲線，結(jié)果顯示，與MSC比較，MSC-HO-1具有類似的生長曲線。以上結(jié)果提示，經(jīng)HO-1基因修飾后并未改變MSC的增殖生長活性及多胚層分化能力，即保留了MSC的干性特征。

國際細胞治療學會間充質(zhì)及組織干細胞委員會提出，人來源BMSC的表面標志分子包括CD105+、CD73+及CD90+，且陽性表達率達95%，而缺乏CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-DR等細胞表面抗原標志物，陽性表達率應低于2%[15]。為了驗證MSC-HO-1表型，取MSC-HO-1行流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示，MSC-HO-1高表達CD29、CD90、CD73及CD105，表達率均>95%；同時幾乎不表達CD34、CD45、CD14和CD11b，與未轉(zhuǎn)染的MSC表型結(jié)果一致，提示慢病毒載體轉(zhuǎn)染本身及HO-1表達并未改變MSC的免疫表型。

綜上所述，本研究利用重組慢病毒載體Lenti-HO-1對MSC成功實施了HO-1基因修飾，結(jié)果還顯示，成功構(gòu)建的MSC-HO-1與MSC比較，具有相似的干性特征，HO-1基因修飾上調(diào)了MSC內(nèi)HO-1的表達，同時也保留了MSC的基本特征。