樊銳鋒 李 威 劉 艷 李洪濤

長期維持在高水平的血糖對人體肝臟功能有嚴重的影響，極易引發(fā)非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)[1]。NAFLD是指除酒精等明確因素所致，以肝實質(zhì)細胞脂肪變性和肝小葉內(nèi)炎癥為特征的臨床病理綜合征[2,3]。其發(fā)病機制包括二次打擊學說、多重打擊學說(胰島素抵抗、細胞凋亡、氧化應激)、腸道微生態(tài)紊亂、自噬等多種理論[4～6]；其中脂類蓄積、氧化應激和胰島素抵抗這幾個方面與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)[7,8]。近年來應用具有較好抗氧化、抗炎藥效的中藥治療NAFLD成為研究熱點，黃酮類物質(zhì)在臨床研究中被證實對NAFLD有較好的臨床療效[9,10]。因此，筆者推測黃酮類物質(zhì)含量較高的中藥金蓮花也可能通過其抗氧化作用對肝細胞的氧化應激起到調(diào)節(jié)作用[11,12]。

金蓮花為毛茛科植物金蓮花(trollius chinensis bunge)的干燥花，為我國傳統(tǒng)中藥，研究表明總黃酮類為其主要有效成分，具有抗氧化、消炎、抑菌和抗病毒等多種藥效[13,14]。依賴于金蓮花較好的抗氧化作用，推測金蓮花總黃酮提取物對高血糖造成的肝細胞功能異常有一定的治療作用[15]。本研究采用培養(yǎng)HEPG2細胞，通過觀察添加高濃度葡萄糖和不同劑量的金蓮花總黃酮后，細胞在脂代謝能力和氧化應激水平等方面的變化來驗證金蓮花總黃酮的作用效果和調(diào)節(jié)機制，為臨床應用此類藥物預防及治療肝細胞損傷提供數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1.材料：(1)HEPG2細胞系:購自上海繼和生物科技有限公司(JH-H1219)，按要求培養(yǎng)、傳代，用于后續(xù)研究。(2)提取物：金蓮花總黃酮提取方法：金蓮花購自黑龍江省呼瑪縣，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學孫慧峰教授鑒定為毛茛科植物金蓮花的干燥花。取金蓮花藥材粉碎后過80目篩，所得金蓮花粉末，加入65%乙醇(物料比1∶20)恒溫超聲波提取(溫度60℃，功率600W，提取時間9min)。減壓濃縮樣品液，上大孔樹脂柱，先用水、10%乙醇洗脫后，用75%乙醇洗脫，濃縮蒸干，將干膏溶解于蒸餾水，再用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，減壓濃縮合并兩部分浸膏得到精制總黃酮浸膏，低溫烘干得總黃酮粉末。(3)藥品及試劑：葡萄糖(美國Sigma公司，G8270-100G)、油酸鈉(美國Sigma公司，662569-10G)、尼羅紅(美國Sigma公司，72485-100MG)、SREBP-1C(英國Abcam公司，ab3259)、FAS(英國Abcam公司，ab133619)、SCD(英國Abcam公司，ab257658)、CPT-1(英國Abcam公司，ab189182)、ACTINβ(美國Santa Cruz公司，sc-70319)、細胞活性氧檢測試劑盒(中國碧云天公司，S0033S)。

2.葡萄糖和金蓮花總黃酮作用濃度的確定：預實驗使用96孔板培養(yǎng)HEPG2細胞，分別加入0、6、12、25、50、100mmol/L的葡萄糖，剩余細胞分別加入0、10、20、40、80、160μmol/L的金蓮花總黃酮，CCK8法檢測不同濃度葡萄糖或金蓮花總黃酮作用24h后細胞活力變化，計算得到葡萄糖培養(yǎng)HEPG2細胞24h的IC50值為90.24mmol/L；金蓮花總黃酮培養(yǎng)HEPG2細胞24h的IC50值為125.1μmol/L。參照Zhang等[16]對高濃度葡萄糖誘導HEPG2細胞的研究，本研究使用終濃度25mmol/L的葡萄糖對細胞進行誘導。為了在不影響細胞正常生長的情況下研究金蓮花總黃酮的藥效機制，實驗中以30% IC50濃度作為金蓮花總黃酮的最高作用濃度。

3.實驗分組：培養(yǎng)的HEPG2細胞隨機分成對照組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組[14]。除對照組外，均加入終濃度為25mmol/L的葡萄糖；模型組不加入金蓮花總黃酮，低劑量組、中劑量組及高劑量組還分別加入終濃度分別為10μmol/L(7.5% IC50)、20μmol/L(15% IC50)和40μmol/L(30% IC50)的金蓮花總黃酮，培養(yǎng)24h后收集細胞。

4.脂肪代謝能力檢測：將油酸鈉(200μmol/L)加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h后，采用尼羅紅(0.5μg/ml)染色30min，其中一部分細胞經(jīng)Hochest33342染色后于熒光顯微鏡下拍照(590nm)；流式細胞儀檢測剩余細胞的紅色熒光強度(590nm)。

5.活性氧簇水平檢測：采用DCFH-DA法，各組培養(yǎng)后加入0.5ml DCFH-DA探針(10μmol/L)，37℃避光孵育30min，其中一部分細胞經(jīng)Hochest33342染色后于熒光顯微鏡下拍照(530nm綠色熒光強度)；流式細胞儀檢測剩余細胞的熒光強度(525nm)。

6.mRNA的相對表達水平檢測：抽提細胞內(nèi)總RNA(Trizol法)，反轉(zhuǎn)錄后，SYBR Green染料法及LC480實時定量熒光PCR儀進行擴增，目標基因引物序列詳見表1，2-△△CT法計算mRNA的相對表達水平。

表1 引物序列

7.蛋白表達水平檢測：采用Western blot法，加入相應抗體使抗原抗體結(jié)合，之后加入ECL進行放射自顯影檢測，用Image J圖像分析軟件對條帶的灰度值進行分析。

結(jié) 果

1.金蓮花總黃酮對脂肪代謝功能的影響：模型組細胞在葡萄糖的誘導下，脂類物質(zhì)明顯蓄積(對照組3678.00±186.95 vs 模型組27822.00±1721.32，P<0.01)，而在添加金蓮花總黃酮后，這種蓄積情況有所改善，且隨著金蓮花總黃酮添加濃度的逐漸增加，效果越發(fā)明顯，在高劑量組中的表現(xiàn)已經(jīng)與對照組差別不大(高劑量組4905.00±165.61，P<0.01)；流式細胞峰值圖的結(jié)果也表明，金蓮花總黃酮降低了尼羅紅染色后高濃度葡萄糖誘導下的HEPG2細胞中紅色熒光的強度。實驗結(jié)果證明金蓮花總黃酮對于高濃度葡萄糖誘導的脂肪蓄積有明顯的改善作用，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴的特點(圖1)。

圖1 各組脂肪代謝水平及流式細胞峰值圖(尼羅紅染色，×40)

2.金蓮花總黃酮對脂肪代謝相關(guān)因子表達水平的影響：本實驗選擇了脂類代謝相關(guān)的膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶(CPT1)作為檢測目標。模型組中細胞在高濃度葡萄糖誘導后，SREBP-1及FAS的mRNA表達水平顯著升高，而SCD和 CPT1的mRNA表達水平顯著降低，而金蓮花總黃酮的添加改善了相關(guān)因子表達水平的變化，在中、高劑量組中表現(xiàn)的極為顯著，具有一定的劑量依賴趨勢(圖2)。蛋白印跡的結(jié)果也顯示出同樣的趨勢，但在FAS的蛋白表達水平的實驗結(jié)果中，金蓮花總黃酮濃度的變化并未顯示出趨勢性差異(圖3、圖4)。上述結(jié)果表明，金蓮花總黃酮可以通過調(diào)節(jié)脂肪代謝的相關(guān)因子來減輕脂肪蓄積水平。

圖2 脂代謝關(guān)鍵因子mRNA表達水平檢測與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

圖3 關(guān)鍵因子蛋白表達水平檢測

圖4 蛋白表達水平灰度分析與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.金蓮花總黃酮對HEPG2細胞ROS水平的影響：肝細胞內(nèi)氧化應激水平及活性氧簇(ROS)的代謝平衡與細胞內(nèi)的脂肪蓄積密切相關(guān)。ROS進行的檢測結(jié)果表明，模型組細胞在葡萄糖的誘導下，ROS水平明顯升高，而金蓮花總黃酮的添加顯著降低了細胞中的ROS水平，流式細胞峰值圖也表現(xiàn)出同樣的變化趨勢(圖5)。對超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSR)及過氧化氫酶(CAT)的mRNA表達水平的實驗結(jié)果表明，金蓮花總黃酮的添加改善了高濃度葡萄糖引起的SOD、GSR和CAT的mRNA表達水平的降低，且在SOD和GSR的mRNA表達水平的結(jié)果中表現(xiàn)出一定的劑量依賴的特點(圖6)。上述結(jié)果表明，金蓮花總黃酮可以通過調(diào)節(jié)氧化應激的關(guān)鍵因子的表達來降低ROS水平，金蓮花總黃酮的抗氧化性對于改善ROS水平有一定作用。

圖5 體外培養(yǎng)HEPG2細胞內(nèi)ROS水平檢測結(jié)果及流式細胞直方圖(DCFH-DA染色，×100)

圖6 細胞內(nèi)抗氧化因子mRNA表達水平與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

討 論

近年來，NAFLD在中國發(fā)生率高達29.2%，且呈逐年增加趨勢，并出現(xiàn)低齡化趨勢，嚴重威脅人民健康[17]。NAFLD與脂肪代謝異常和氧化應激均有密切關(guān)系[18, 19]。本研究結(jié)果表明，高濃度葡萄糖誘導引起HEPG2細胞的脂肪蓄積，而脂肪的不斷蓄積提高了ROS水平，這符合關(guān)于NAFLD的“二次打擊學說”，肝臟是ROS攻擊的主要器官之一，肝臟當中的實質(zhì)細胞最容易受氧化應激誘導損傷，而脂肪蓄積是引起ROS水平提高的重要原因[20]。

金蓮花做茶飲古籍中就有記載，“謂作常茶飲，可以消災延壽”，可見金蓮花的保健作用早已得到關(guān)注[21]。結(jié)果表明，金蓮花總黃酮能夠降低體外培養(yǎng)細胞內(nèi)的脂類物質(zhì)積累，并顯著降低脂類物質(zhì)積累所造成的肝細胞內(nèi)ROS 水平的異常升高，并進一步證實這種作用是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂類代謝相關(guān)因子(SREBP-1、FAS、SCD和CPT1)和抗氧化因子(SOD、GSR和CAT)的表達水平來實現(xiàn)的，這可作為金蓮花做茶飲具有保健效果的依據(jù)，也對于NAFLD的早期預防和治療具有非常重要的意義。

目前國內(nèi)外多項研究證實，從桑葉和柑橘等中藥材中提取的黃酮類成分對NAFLD有較好的療效，本研究結(jié)果也證實金蓮花總黃酮對高濃度葡萄糖誘導下的HEPG2細胞所產(chǎn)生的氧化應激損傷和脂類代謝的異常有一定的抑制作用[22,23]。中藥金蓮花有效成分以黃酮類化學成分為主，約占金蓮花干質(zhì)量的18%，主要包括葒草素、牡荊素、異當藥黃素、槲皮素、異槲皮素、金蓮花碳苷Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ及其衍生物等，金蓮花中各種黃酮類成分對于NAFLD的藥效和作用機制還有待于進一步研究驗證[24]。

本研究通過高濃度葡萄糖的誘導培養(yǎng)使HEPG2細胞表現(xiàn)出非酒精性脂肪肝的病癥，脂肪蓄積，ROS水平升高。金蓮花總黃酮的添加能夠緩解脂肪蓄積，降低ROS水平，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴的特點，為進一步研究金蓮花總黃酮中成分治療非酒精性脂肪肝和金蓮花相關(guān)藥品及保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。