金鵬程 林 杰 朱鵬磊 王歐洋 吳 昊 童凌云

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，也是致死率最高的腫瘤[1]。既往研究認為小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)主要的免疫細胞從而限制了其抗原遞呈過程，而最新研究表明腦組織內(nèi)存在活躍的免疫監(jiān)視和免疫響應(yīng)機制[2,3]。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中程序性細胞死亡配體1(PD-L1)表達水平升高，主要組織相容性復(fù)合物表達降低，小膠質(zhì)細胞釋放大量抗炎因子，具有腫瘤免疫抑制特征[4]。研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中PD-L1表達水平與膠質(zhì)瘤預(yù)后呈負相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)放化療后復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤組織具有更強的免疫原性[4～6]。

替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一種具有抗腫瘤活性的烷化劑，是膠質(zhì)瘤治療的一線化療用藥。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)TMZ治療后組織PD-1表達顯著升高[7]。另一項更大樣本量的臨床研究則發(fā)現(xiàn)PD-L1表達水平與患者總生存期呈負相關(guān)[5]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TMZ處理后的膠質(zhì)瘤細胞強烈抑制外周單核細胞的激活和促炎性因子的表達，同時TMZ促進PD-L1表達。將PD-1抑制劑與TMZ聯(lián)用可以顯著增加腫瘤組織T細胞浸潤，改善T細胞耗竭，增強膠質(zhì)瘤化療敏感度[8～10]。

二甲雙胍是一個代謝調(diào)控藥物，由于其臨床應(yīng)用成熟、成本低廉，研究者利用其與各種治療方式開展聯(lián)合治療，以尋求更優(yōu)的治療策略。二甲雙胍可通過mTOR通路抑制HIF-1α表達，通過HIF-1α/PFKFB3/PFK1途徑降低糖酵解活性從而抑制肝癌細胞增殖，還可通過HIF-1α/PKM2通路抑制成纖維細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11, 12]。有研究表明二甲雙胍可改善低氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的敏感度[13]。本研究探討了如何提升膠質(zhì)瘤現(xiàn)有治療藥物敏感度，為尋找新的有效干預(yù)策略提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.細胞培養(yǎng)：人源膠質(zhì)瘤細胞株U87MG購自中國科學(xué)院細胞庫。含10% FBS的MEM完全培養(yǎng)基37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，每3天傳代1次。

2.藥物處理：二甲雙胍處理濃度為10mmol/L，mTOR激動劑MHY1485處理濃度為2μmol/L，TMZ處理濃度為0.1mmol/L，處理時長為48h。

3.Western blot法：RIPA緩沖液(Beyotime)冰上裂解U87MG，然后BCA方法測量總蛋白濃度。20μg蛋白質(zhì)進行10% SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜。通過與5% BSA在室溫下孵育阻斷非特異性結(jié)合。然后將膜與一抗(1∶1000)在4℃孵育過夜。使用的一抗均購自美國Cell Signaling Technology生物公司：HIF-1α(#36169)，HK2(#2867)，PKM2(#4053)，PFKFB3(#13123)，PD-L1(#13684)，mTOR(#2983)，p-mTOR(#5536)。次日將膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育。使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Beyotime公司)檢測免疫印跡信號。

4.qRT-PCR：使用Trizol(日本TaKaRa公司)從U87MG中提取總RNA。使用Nanodrop(美國Thermo Scientific公司)在260和280nm的波長處讀取樣品吸光度，測定RNA的完整性和濃度。緊接著利用cDNA合成試劑盒(美國Thermo Scientific公司)合成cDNA。引物序列詳見表1。使用2-ΔΔct方法評估基因的相對表達。使用美國ABI StepOne實時PCR熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)進行qRT-PCR。

表1 相關(guān)引物序列

5.細胞免疫熒光：將U87MG接種于24孔板。4%多聚甲醛固定U87MG，用1PBS溶液(+0.1% Triton X-100)通透，抗山羊血清封閉，緊接著HIF-1α一抗 (1∶150) 4℃孵育過夜。次日，相應(yīng)的熒光二抗 (1∶200) 水平搖床孵育2h，DAPI (1∶1000) 避光染核。最后于熒光顯微鏡下觀察。

6.葡萄糖消耗量和乳酸釋放量：葡萄糖消耗檢測采用葡萄糖檢測試劑盒，乳酸釋放量檢測采用乳酸檢測試盒，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。U87MG經(jīng)過實驗處理后，收集上清，加入相應(yīng)試劑。自動酶標儀測定505nm波長的吸光度葡萄糖消耗量；測定530nm波長的吸光度乳酸釋放量。

7.Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡：收集U87MG，凋亡試劑盒(美國B D公司)處理細胞，注意避光。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測U87MG細胞凋亡率，采用FACSDiva 6.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。

8.CCK8測定IC50：經(jīng)過二甲雙胍或MHY1485處理后，將U87MG接種到 96 孔板。加入TMZ，恒溫培養(yǎng)48h。加入CCK8工作液，酶標儀測定450nm 波長處吸光度，計算各組U87MG的生長抑制率。采用GraphPad Prism 8.0分析軟件計算 IC50值，進而反映U87MG對TMZ的藥物敏感度。

結(jié) 果

1.替莫唑胺對膠質(zhì)瘤細胞HIF-1α表達的影響：本研究將U87MG用TMZ(0.1mmol/L)處理0、24、48、72h，HIF-1α表達隨著TMZ處理時間增加而升高(圖1A和圖1B)，細胞免疫熒光結(jié)果表明，48h后HIF-1α核內(nèi)水平顯著升高(圖1C)。

圖1 TMZ影響膠質(zhì)瘤細胞HIF-1α表達A.Western blot法;B.qRT-PCR；C.TMZ不同處理時間下，細胞免疫熒光檢測HIF-1α;與0h組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

2.HIF-1α表達抑制對膠質(zhì)瘤細胞糖酵解活性以及PD-L1的影響：在U87MG中下調(diào)HIF-1α表達，發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵酶HK2、PKM2、PFKFB3表達下調(diào)，并且葡萄糖消耗量和乳酸釋放量均顯著降低，糖酵解活性降低(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HIF-1α表達使得糖酵解活性降低，PD-L1表達顯著下調(diào)，進而影響膠質(zhì)瘤細胞免疫逃逸的發(fā)生。

圖2 下調(diào)HIF-1α表達影響膠質(zhì)瘤細胞糖酵解活性以及PD-L1表達A.檢測siHIF-1α干擾效果; B.葡萄糖消耗量; C.乳酸釋放量; D.Western blot法檢測糖酵解關(guān)鍵酶和PD-L1表達; E.qRT-PCR；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

3.替莫唑胺聯(lián)合二甲雙胍對膠質(zhì)瘤細胞的作用：TMZ聯(lián)合二甲雙胍(10mmol/L)處理U87MG細胞株，結(jié)果表明，與TMZ誘導(dǎo)組比較，TMZ+二甲雙胍組HIF-1α表達下調(diào)，但均比對照組表達高(圖3A～C)。測定糖酵解活性發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組糖酵解活性降低，糖酵解關(guān)鍵酶表達顯著下調(diào)(圖3B和圖3C)，同時葡萄糖消耗量和乳酸釋放量降低(圖3D和圖3E)。Western blot法和qRT-PCR檢測結(jié)果表明聯(lián)合處理組PD-L1蛋白表達下調(diào)(圖3B和圖3C)。Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果表明聯(lián)合處理組凋亡率升高(圖3F)。CCK8 實驗檢測二甲雙胍對膠質(zhì)瘤細胞TMZ化療敏感度的影響。通過計算半數(shù)抑制濃度(IC50)反映細胞對TMZ的敏感度。結(jié)果顯示TMZ+二甲雙胍組IC50減小(圖3G)。

圖3 TMZ聯(lián)合二甲雙胍對膠質(zhì)瘤細胞的作用A.細胞免疫熒光;B.Western blot法;C.qRT-PCR;D.葡萄糖消耗量;E.乳酸釋放量;F.Annexin V-FITC/PI染色;G.CCK8檢測IC50;與以不做任何處理的U87MG為對照組比較，*P<0.01，**P=0.000; 與以僅用TMZ處理為對照組比較，**P=0.000

4.mTOR激動劑減弱二甲雙胍對膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺化療敏感度的增強作用：Western blot法和qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與TMZ誘導(dǎo)組比較，TMZ誘導(dǎo)+二甲雙胍組mTOR磷酸化水平降低，HIF-1α表達下調(diào)，并且PD-L1表達顯著降低(圖4A和圖4B)。CCK8實驗檢測TMZ化療敏感度(圖4C)，發(fā)現(xiàn)MHY1485處理后，IC50值一定程度變大。

圖4 MHY1485對膠質(zhì)瘤細胞的影響A.Western blot法;B.qRT-PCR;C.CCK8檢測IC50;**P<0.01，***P=0.000

討 論

膠質(zhì)瘤細胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境的代謝重構(gòu)是影響膠質(zhì)瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫治療效果的關(guān)鍵因素[14]。膠質(zhì)瘤細胞主要以糖酵解方式快速獲取能量，同時將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。在腫瘤微環(huán)境中，膠質(zhì)瘤細胞消耗大量葡萄糖和氧氣，造成局部缺氧，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白生成，進而抑制NK細胞活性并激活免疫抑制性CD4+T細胞，導(dǎo)致腫瘤免疫抑制微環(huán)境；代謝產(chǎn)物乳酸的堆積促使單核細胞分化為樹突狀細胞，通過分泌免疫抑制因子、抑制T細胞免疫應(yīng)答而直接抑制免疫反應(yīng)[15]。本研究聯(lián)合二甲雙胍與TMZ作用膠質(zhì)瘤細胞U87MG，改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤細胞免疫逃逸，同時研究其作用機制。

本研究用TMZ處理U87MG，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達升高，同時48h后HIF-1α在核內(nèi)水平顯著升高。有研究報道，TMZ處理原代膠質(zhì)瘤細胞可誘導(dǎo)HIF-1α水平升高并大量入核[16]。與本研究結(jié)果一致。下調(diào)U87MG中HIF-1α表達，研究發(fā)現(xiàn)糖酵解活性降低，同時發(fā)現(xiàn)PD-L1表達顯著下調(diào)。Palsson-McDermott等[17]研究發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵酶PKM2能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性從而促進PD-L1的表達。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)了PFKFB3通過NF-κB依賴的途徑促進PD-L1表達。以上研究表明，TMZ能夠升高HIF-1α在核內(nèi)水平，進而增強糖酵解活性，促進PD-L1表達。

TMZ雖然是膠質(zhì)瘤治療的一線化療用藥，但是上調(diào)了PD-L1表達，促使膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，進而導(dǎo)致治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)，因此TMZ敏感度是膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵因素[8,9]。二甲雙胍能夠抑制HIF-1α表達，進而降低糖酵解活性從而抑制細胞增殖，而且多篇研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可改善低氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的敏感度[13,19，20]。但是，二甲雙胍的具體作用機制尚不明確。本研究將TMZ聯(lián)合二甲雙胍處理U87MG，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達下調(diào)，糖酵解活性降低，PD-L1蛋白表達下調(diào)，進而影響膠質(zhì)瘤細胞免疫逃逸的發(fā)生。同時細胞凋亡被促進，替莫唑胺IC50值變小，說明二甲雙胍能夠增強膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的化療敏感度。進一步研究發(fā)現(xiàn)mTOR激動劑能夠減弱二甲雙胍對膠質(zhì)瘤細胞TMZ化療敏感度的增強作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍能夠增強膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的化療敏感度，同時闡明了其作用機制，為提升膠質(zhì)瘤現(xiàn)有治療藥物敏感度、尋找新的有效干預(yù)策略提供了科學(xué)依據(jù)。