成 睿 趙 琴 蔣玉輝

肝癌是最常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)生率位于全球第6位，并且在腫瘤相關(guān)的死亡中排名第4位[1]。肝癌是一個(gè)病因復(fù)雜的疾病，而乙型肝炎-肝硬化-肝癌是最常見(jiàn)的肝癌發(fā)展進(jìn)程之一[2，3]。我國(guó)作為一個(gè)乙型肝炎大國(guó)，肝癌的發(fā)生率日益增高，且大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期階段，目前我國(guó)肝癌的5年生存率僅為12.1%[4～6]。因此闡明肝癌發(fā)生的分子機(jī)制并確定有效的分子靶標(biāo)對(duì)于肝癌的早期診斷及治療具有重要意義。

嘌呤核苷酸是生命活動(dòng)所必須的有機(jī)低分子，它不僅是DNA及RNA的基本成分，還是體內(nèi)重要的能量來(lái)源，它的合成途徑分為從頭合成及補(bǔ)救途徑兩種方式[6]。越來(lái)越多的證據(jù)表明在癌變的過(guò)程中存在嘌呤核苷酸的代謝失衡，且其合成與分解的代謝異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7～9]。肝臟作為嘌呤核苷酸最主要的合成器官，為人體的正常生命活動(dòng)提供了充足的原料。而在肝癌發(fā)生時(shí)，合成嘌呤核苷酸的代謝酶異常活躍，腺苷酸琥珀酸合成酶作為嘌呤從頭合成的關(guān)鍵酶，參與了IMP向ATP轉(zhuǎn)化的第1個(gè)步驟，而腺苷酸琥珀酸合成酶2(adenylosuccinate synthase isozyme 2，ADSS)是其在肝臟中的存在形式，在腫瘤發(fā)生時(shí)異常表達(dá)，而其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的功能至今未能闡明[10]。

本研究在對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)探索的基礎(chǔ)上，利用肝癌細(xì)胞探索ADSS在肝癌中的表達(dá)及其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為其作為肝癌早期診斷及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：(1)細(xì)胞株：人肝臟細(xì)胞株LO2、人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7和Hep3B購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，人肝癌細(xì)胞株LM3和MHCC-97H購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)IBS細(xì)胞資源中心。(2)主要試劑及耗材：無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒和凝膠純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、Phanta保真酶、T4 DNA連接酶及Script SYBR Green PCR 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。DH5α、結(jié)晶紫溶液、腺苷-5-單磷酸二鈉鹽和4%多聚甲醛購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。Transwell小室購(gòu)自英國(guó)Corning公司?？贵wADSS購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，N-cadherin、E-cadherin及GAPDH購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Vimentin購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司，F(xiàn)lag 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)數(shù)據(jù)獲?。篣ALCAN網(wǎng)頁(yè)分析TCGA中ADSS的表達(dá)，數(shù)據(jù)包括371例肝癌組織與50例正常組織。使用Kaplan-MeierPlotter對(duì)肝癌患者的5年生存期進(jìn)行分析，生存期分析中按ADSS的中位表達(dá)量將其分為低表達(dá)ADSS的肝癌患者(180例)和高表達(dá)ADSS的肝癌患者(184例)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)加入10%的胎牛血清，100U/L的青霉素與鏈霉素，細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37℃、95%飽和濕度及5%CO2。(3)蛋白印跡法：裂解液提取細(xì)胞的總體蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，蛋白印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳后，100V恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗于4℃搖床孵育過(guò)夜，次日用PBST洗3次，每次10min，二抗在室溫下孵育2h， PBST洗3次后化學(xué)發(fā)光成像。(4)質(zhì)粒構(gòu)建：shRNA的質(zhì)粒載體為pLKO.1，酶切位點(diǎn)為AgeⅠ，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體為pLVX-IRES-Neo-3xFlag，酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ及BamHⅠ，引物序列詳見(jiàn)表1。(5)慢病毒包裝：293T提前鋪板，密度約為80%～90%，細(xì)胞貼壁后，將慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G，psPAX2、目的質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑加入500μl培液中，混勻后靜置15min后加入293T中，培養(yǎng)48h后收集上清，離心過(guò)濾后使用。(6)細(xì)胞系構(gòu)建：細(xì)胞鋪板密度為30%～40%，待其貼壁后，加入2ml病毒，500μl DMEM完全培養(yǎng)基，加入Polybrene篩選細(xì)胞，培養(yǎng)箱培育8h，換為2ml完全培養(yǎng)基。兩天后添加1μg/ml的嘌呤霉素持續(xù)篩選。(7)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：由于HepG2敲減穩(wěn)定株的效果不明顯，故使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞鋪板密度約為60%～70%，提前2h換液，將目的質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑加至500μl的培液中混勻，靜置15min后加入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。(8)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔板背面每隔1cm劃線，每孔種入5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿后使用200μl的槍頭劃線，PBS沖洗3次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、24、48h于顯微鏡下拍照。(9)Transwell實(shí)驗(yàn)：Transwell實(shí)驗(yàn)采用8μm聚酯膜小室。消化細(xì)胞，離心后PBS洗2次，用無(wú)血清DMEM重懸細(xì)胞，取200μl 含3×105細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基加入小室，下室加入600μl含15% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗后結(jié)晶紫染色20min，PBS清洗后用棉簽擦拭小室上層，顯微鏡下取5個(gè)視野拍照。(10)實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Trizol法提取細(xì)胞RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)Script SYBR Green PCR 試劑盒及羅氏LightCycler96檢測(cè)儀檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參，mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算，引物序列詳見(jiàn)表1。(11)AMP回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)：腺苷-5-單磷酸二鈉鹽用稀鹽酸溶解，使用PBS將其稀釋為100mmol/L的母液。細(xì)胞處理濃度為100nmol/L，其對(duì)照組加入相應(yīng)濃度的鹽酸。

表1 質(zhì)粒及實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ADSS在肝癌中表達(dá)量及與肝癌患者的5年生存率相關(guān)性：使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA的肝癌組織分析發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中ADSS的表達(dá)上調(diào)(圖1A)。使用Kaplan-MeierPlotter分析發(fā)現(xiàn)ADSS高表達(dá)患者5年生存率明顯低于ADSS低表達(dá)患者(圖1B)。隨后在蛋白水平進(jìn)行分析，與肝臟正常細(xì)胞LO2比較，肝癌細(xì)胞ADSS的表達(dá)量增加，而在mRNA水平大多數(shù)肝癌細(xì)胞表達(dá)量增加。

圖1 ADSS在肝癌中表達(dá)量及肝癌患者的5年生存率相關(guān)性A.肝癌組織與正常肝組織ADSS的mRNA表達(dá)量；B.ADSS表達(dá)水平與患者5年生存率相關(guān)性；C.肝癌細(xì)胞及正常肝臟細(xì)胞ADSS的蛋白表達(dá)量；D.肝癌細(xì)胞與正常肝臟細(xì)胞中ADSS的mRNA的表達(dá)量。*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

2.ADSS沉默效果及肝癌細(xì)胞間的黏附性改變：為了探究ADSS在肝癌中的生物學(xué)作用，在ADSS表達(dá)較高的HepG2及LM3中沉默ADSS基因，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示沉默ADSS的肝癌細(xì)胞ADSS的表達(dá)量明顯下調(diào)(圖2A、圖2B)，并且使肝癌細(xì)胞間黏附性發(fā)生改變(圖2C)。

圖2 ADSS沉默效果及肝癌細(xì)胞間的黏附性改變A.HepG2細(xì)胞ADSS基因沉默效果驗(yàn)證；B.LM3細(xì)胞ADSS基因沉默效果驗(yàn)證；C.ADSS基因沉默后細(xì)胞黏附性發(fā)生改變(×200)

3.ADSS對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移的影響：使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行檢測(cè)，ADSS基因沉默后明顯抑制了HepG2及LM3的遷移能力(圖3A、圖3B)。使用Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)肝癌的遷移能力進(jìn)行驗(yàn)證，在HepG2及LM3中沉默ADSS基因后遷移能力明顯減弱(圖3C)。

圖3 ADSS對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移的影響A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADSS基因沉默對(duì)HepG2遷移功能的影響(×100)；B.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADSS基因沉默對(duì)LM3遷移功能的影響(×100)；C.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADSS基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2及LM3遷移功能的影響(結(jié)晶紫染色，×200)。*P=0.000

4.ADSS對(duì)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化的影響:使用EMT相關(guān)抗體對(duì)沉默ADSS的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沉默ADSS的HepG2及LM3中EMT相關(guān)指標(biāo)N-cadherin、Vimentin均較對(duì)照組細(xì)胞明顯下調(diào)，E-cadherin較對(duì)照組明顯增加(圖4)。

圖4 ADSS對(duì)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化的影響A.HepG2細(xì)胞中ADSS基因沉默后EMT相關(guān)指標(biāo)的影響；B.LM3細(xì)胞中ADSS基因沉默后EMT相關(guān)指標(biāo)的影響

5.ADSS基因及代謝產(chǎn)物回補(bǔ)恢復(fù)了LM3-Sh-ADSS細(xì)胞的遷移能力：為了確定ADSS的表達(dá)在細(xì)胞遷移中的作用，對(duì)LM3-Sh-ADSS2進(jìn)行基因及代謝產(chǎn)物回補(bǔ)。ADSS的基因回補(bǔ)完全恢復(fù)了EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)及LM3的遷移能力(圖5、圖6A)，而在代謝產(chǎn)物回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，由于其下游代謝產(chǎn)物AMP的細(xì)胞吸收及利用率有限，其EMT相關(guān)分子標(biāo)志物及細(xì)胞的遷移功能僅得到部分回復(fù)(圖5、圖6B)。

圖5 ADSS基因及代謝產(chǎn)物回補(bǔ)對(duì)EMT相關(guān)分子的影響

圖6 ADSS基因及代謝產(chǎn)物回補(bǔ)恢復(fù)了肝癌細(xì)胞的遷移能力A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADSS代謝產(chǎn)物回補(bǔ)及基因回補(bǔ)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移功能的影響(×100)；B. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADSS代謝產(chǎn)物回補(bǔ)及基因回補(bǔ)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移功能的影響(結(jié)晶紫染色，×200)。*P<0.05,**P=0.000

討 論

肝癌在我國(guó)是一種高發(fā)生率、高致死率的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)典型的多階段演變過(guò)程[11～13]。目前肝癌的發(fā)病原因及具體機(jī)制尚不明確，故筆者以肝癌為研究對(duì)象，力圖尋找肝癌新的診斷及治療靶點(diǎn)。腫瘤與代謝是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)之一，多篇文獻(xiàn)報(bào)道嘌呤在腫瘤發(fā)生過(guò)程中常存在代謝失衡[14，15]。參與嘌呤核苷酸從頭合成及補(bǔ)救途徑的多種代謝酶在腫瘤發(fā)生時(shí)異常上調(diào)，并且通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。ADSS作為嘌呤核苷酸從頭合成中的關(guān)鍵酶，參與ATP的合成，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示ADSS在肝癌中高表達(dá)，而其在腫瘤中的具體作用及機(jī)制至今無(wú)人報(bào)道，故本文探究了ADSS在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

本研究通過(guò)對(duì)TCGA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中ADSS的表達(dá)水平明顯高于正常組織，且ADSS高表達(dá)的肝癌患者較ADSS低表達(dá)的肝癌患者5年生存率明顯降低，隨后對(duì)肝癌細(xì)胞及肝臟正常細(xì)胞的蛋白及mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常肝臟細(xì)胞比較ADSS在肝癌細(xì)胞表達(dá)量增加。沉默肝癌細(xì)胞ADSS后發(fā)現(xiàn)，ADSS的缺失導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性的改變，進(jìn)一步的生理功能研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSS的下調(diào)抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力。因此可以推斷ADSS在肝癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是腫瘤患者預(yù)后不良的重要原因，多篇文獻(xiàn)表明肝癌的轉(zhuǎn)移與EMT的過(guò)度激活密切相關(guān)[17，18]。其常通過(guò)改變細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，而在EMT發(fā)生的過(guò)程中上皮標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin表達(dá)量的減少，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)量的增加是其標(biāo)志性的改變[19]。使用EMT相關(guān)抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默ADSS顯著改變EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，這表明ADSS可能通過(guò)激活EMT促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移，隨后對(duì)ADSS基因沉默的LM3-ShADSS2進(jìn)行基因及代謝產(chǎn)物回補(bǔ)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSS的基因及代謝產(chǎn)物回補(bǔ)恢復(fù)了ADSS缺失造成的EMT分子標(biāo)志物及遷移的改變。本研究揭示了ADSS對(duì)肝癌遷移的影響，后期筆者將進(jìn)一步研究ADSS在肝癌中調(diào)控的具體機(jī)制，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索ADSS在體內(nèi)存在的意義。

綜上所述，ADSS在肝癌中表達(dá)量增加，其表達(dá)與患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān)，在肝癌中ADSS對(duì)肝癌細(xì)胞遷移具有一定的促進(jìn)作用。因此，ADSS或可為肝癌的早期診斷及治療提供新的思路。