王瓊峰 韓雨清 周 陽 孫 卓 包海軍 蒯錦霞 蔡紅星

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)又稱延遲性心因性反應(yīng)，是指突發(fā)性、威脅性、災(zāi)難性等刺激性生活事件或處境所導(dǎo)致個體延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)存在的精神障礙。PTSD作為一種嚴重的精神疾病，其臨床表現(xiàn)以闖入性創(chuàng)傷再體驗癥狀(閃回)、回避和麻木類癥狀、持續(xù)性焦慮和警覺水平增高癥狀為主要特征[1,2]。

對PTSD患者的研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷刺激期間，海馬等多個腦區(qū)在短期內(nèi)可發(fā)生神經(jīng)可塑性改變，神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子調(diào)控紊亂，線粒體功能受損從而導(dǎo)致神經(jīng)細胞受損[3]。在慢性刺激過程中，遭受刺激患者腦內(nèi)自由基水平較正常增高，這會引起神經(jīng)細胞脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致由自由基介導(dǎo)的病理和隨后的神經(jīng)毒性，引起神經(jīng)細胞凋亡、壞死、其他結(jié)構(gòu)細胞損傷和修飾[4]。這些研究證明刺激反應(yīng)會損傷大腦，引起腦內(nèi)神經(jīng)細胞的損傷。腦功能的預(yù)后與各種繼發(fā)性損傷密切相關(guān)，如自噬等重要分子機制同樣參與了腦神經(jīng)細胞繼發(fā)性死亡的過程。FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子是Fox基因O亞家族的一個重要成員，其在細胞的增殖、凋亡、自噬、炎癥等生物進程中發(fā)揮著重要作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a是刺激反應(yīng)中多個分子信號通路的交匯點，當(dāng)機體遭受刺激時，F(xiàn)oxO3a能夠通過影響自噬基因的表達來激活不同類型細胞的自噬機制。但目前在PTSD模型中，F(xiàn)oxO3a參與神經(jīng)細胞自噬的調(diào)控較少有相關(guān)文獻報道。本研究通過檢測SPS刺激下小鼠的行為學(xué)改變及小鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)FoxO3a、LC3蛋白的表達情況，初步研究PTSD小鼠海馬神經(jīng)細胞自噬過程中FoxO3a蛋白的表達變化。

材料與方法

1.實驗材料： (1)動物：成年雄性昆明小鼠68只，體質(zhì)量25～30g，購自徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(蘇)2016-0028。(2)試劑：BCA蛋白含量檢測試劑盒(編號KGP902)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(編號P10100)購自蘇州新賽美生物科技有限公司；兔抗Akt抗體(編號#4691)、兔抗p-Akt抗體(編號#13038)、兔抗FoxO3a抗體(編號#2497)、兔抗p-FoxO3a抗體(編號#9466)、兔抗LC3B抗體(編號#3868)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗P62抗體(編號sc-25575)購自美國Santa Cruz Bio-technology公司；兔抗β-actin抗體(編號20536-1-AP)和山羊抗兔IgG二抗(編號SA00001-2)購自美國Proteintech Group公司。

2.動物分組：行為學(xué)檢測(共20只)，隨機分為Control組和PTSD組，每組各10只；Western blot法檢測實驗(共36只)，隨機分為Control組(6只)和PTSD組，PTSD組依照1、3、7、14、28天5個時間點各設(shè)亞組，每個亞組各隨機分配6只；免疫熒光檢測實驗(共12只)，隨機分為Control組和PTSD組，每組各6只。

3.PTSD動物模型的制備：首先小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用國際上公認的單一連續(xù)刺激(single prolonged stress，SPS)方法制備PTSD小鼠模型[6]：先將小鼠禁錮2h，之后立即將禁錮解除的小鼠強迫游泳20min(水深40cm，水溫25℃)，休息15min后進行乙醚麻醉至小鼠意識喪失，待其自然蘇醒后分籠常規(guī)飼養(yǎng)，期間不再給予小鼠任何刺激。

4.曠場實驗：本實驗采用曠場實驗箱，平均分為底面積相等的4個箱體，每個箱體規(guī)格50cm×50cm×40cm，箱體外周壁為黑色，靠壁底部區(qū)域面積組成外周活動區(qū)，其余部分區(qū)域面積組成中央活動區(qū)。測試前將小鼠放置于曠場實驗箱中適應(yīng)15s，實驗開始時，將小鼠放置于曠場正中央，在操作者完成放開小鼠動作的同時，實驗箱正上方的攝像機開始同步跟蹤記錄，記錄時間為5min。本次曠場實驗評估指標為小鼠的活動總路程(外周區(qū)域+中央?yún)^(qū)域)、中央?yún)^(qū)域活動的路程、中央?yún)^(qū)域停留的時間。

5.高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮裝置由白色不透明有機材料制成，整個裝置離地0.5m高，由兩個開臂大小為長×寬(30cm×6cm)、兩個閉臂大小為長×寬×高(30cm×6cm×15cm)及開臂和閉臂之間的中央?yún)^(qū)域(6cm×6cm)組成。實驗開始時，將小鼠放置于高架十字迷宮的中央?yún)^(qū)域，頭部統(tǒng)一朝向開臂方向，釋放后實驗人員迅速離開的同時，啟動攝像系統(tǒng)開始跟蹤記錄，記錄時間為5min，實驗中跌落的小鼠則淘汰此數(shù)據(jù)。本次高架十字迷宮實驗評估指標：小鼠進入開臂次數(shù)占總次數(shù)(進入開臂次數(shù)+進入閉臂次數(shù))的百分比、小鼠在開臂停留時間占總停留時間(開臂停留時間+閉臂停留時間)的百分比。

6.Morris水迷宮實驗：水迷宮為一個黑色圓形水池(直徑105cm，高50cm)，池內(nèi)水深30cm，水溫25℃左右，水池均等分為4個象限，將一個直徑為6cm的白色透明圓形站臺放置于靶象限(設(shè)為第一象限)內(nèi)，站臺位置距離池壁30cm，高度低于水面下1cm。具體實驗步驟：(1)定位航行實驗：每只小鼠每天訓(xùn)練4次，每次間隔1min，持續(xù)訓(xùn)練4天。實驗前，去掉站臺，讓小鼠自由游泳60s以充分適應(yīng)環(huán)境。實驗開始時，將站臺隱蔽于第一象限內(nèi)，將小鼠頭朝池壁隨機從東北(NE)、東南(SE)、西南(SW)、西北(NW) 4個方向放入水池內(nèi)，自由游泳60s尋找隱蔽的站臺，60s內(nèi)找到站臺，記錄所用時間為逃避潛伏期。若60s內(nèi)未找到站臺的小鼠，引導(dǎo)至站臺，站臺上停留30s，記錄逃避潛伏期為60s。(2)空間探索實驗：學(xué)習(xí)的第5天撤掉水下站臺，從目標象限(站臺)的對側(cè)象限，將小鼠頭朝池壁放入水池內(nèi)，記錄60s內(nèi)小鼠的運動軌跡和目標象限(站臺)停留情況。本次Morris水迷宮實驗評估指標：60s內(nèi)小鼠的逃避潛伏期、穿越原站臺次數(shù)、原站臺象限的停留時間。

7.Western blot法檢測：冰臺上操作剖離海馬組織，預(yù)先按RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的比例混合配制好蛋白組織裂解液，加入裂解液充分勻漿組織，冰上靜置裂解30min，高速低溫(13000r/min，20min)后取上清液。BCA法測定各組蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，95℃變性15min。配置SDS-PAGE凝膠，濃縮膠恒壓80V電泳30min，分離膠恒壓110V電泳至溴酚藍到達分離膠底部，用電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2h；一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜10min×3次；二抗室溫孵育2h，TBST洗膜10min×3次。PVDF膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，暗室內(nèi)曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

8.免疫熒光染色實驗：小鼠腦組織灌注取材，放置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定36h，經(jīng)20%、30%蔗糖溶液中4℃梯度沉糖脫水，冷凍切片機海馬冠狀切片，厚度20μm，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r室溫放置復(fù)溫30min，PBS洗5min×3次；0.3%TritonX-100通透10min，PBS洗5min×3次；10%山羊血清封閉1h；一抗4℃孵育過夜，第2天室溫孵育30min進行復(fù)溫，PBS洗10min×3次；熒光二抗室溫避光孵育2h，PBS洗10min×3次；DAPI復(fù)染核，室溫孵育10min，PBS洗5min×3次；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

結(jié) 果

1.曠場實驗檢測：與Control組比較，PTSD組小鼠在曠場實驗箱內(nèi)活動總路程明顯減少(P<0.01)，其在中央?yún)^(qū)域活動路程、中央?yún)^(qū)域停留時間也均減少(P<0.01，圖1)。

圖1 兩組小鼠曠場實驗檢測結(jié)果(n=10)A.運動軌跡結(jié)果圖；B.兩組小鼠在曠場箱內(nèi)活動總路程、中央?yún)^(qū)域活動路程和停留時間的比較；與Control組比較，*P<0.01

2.高架十字迷宮實驗檢測：與Control組比較，PTSD組小鼠進入開臂次數(shù)百分比、開臂停留時間百分比均明顯降低，兩組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。從小鼠的運動軌跡及測試分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，PTSD組小鼠在閉臂內(nèi)的活動總路程和總時間顯著高于開臂。

圖2 兩組小鼠高架十字迷宮檢測結(jié)果(n=10)A.運動軌跡結(jié)果圖；B.兩組小鼠進入開臂次數(shù)和開臂停留時間百分比的比較；與Control組比較，*P<0.01

3.Morris水迷宮實驗檢測：在定位航行實驗中，與Control組比較，PTSD組小鼠逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)；在空間探索實驗中，與Control組比較，PTSD組小鼠穿越原站臺的次數(shù)和原站臺象限的停留時間明顯減少(P<0.01，圖3)。

圖3 兩組小鼠Morris水迷宮檢測結(jié)果(n=10)A.運動軌跡結(jié)果圖；B.兩組小鼠逃避潛伏期、穿越原站臺次數(shù)、原站臺象限的停留時間比較；與Control組比較，*P<0.01

4.Western blot法檢測自噬信號通路相關(guān)蛋白的表達：與Control組比較，PTSD組小鼠海馬神經(jīng)細胞p-Akt蛋白表達水平在1天時出現(xiàn)激活上調(diào)，之后表達開始下降；PTSD組海馬組織FoxO3a蛋白表達增加，p-FoxO3a蛋白表達減少；PTSD組海馬自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，p62蛋白表達水平降低，兩組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。SPS刺激后PTSD組各組蛋白表達隨時間點變化而變化，F(xiàn)oxO3a蛋白能夠在短暫SPS刺激下，迅速感受Akt蛋白的變化；SPS刺激后7、14天時間點，觀察到PTSD小鼠海馬LC3明顯增多，F(xiàn)oxO3a蛋白表達水平也隨之增加。

圖4 Western blot法檢測各組蛋白的表達情況(n=3)與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.免疫熒光檢測小鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)FoxO3a和LC3的表達：熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a蛋白與CoraLite488標記的熒光二抗結(jié)合，其陽性反應(yīng)呈現(xiàn)綠色熒光；LC3蛋白與CoraLite594標記的熒光二抗結(jié)合，其陽性反應(yīng)呈現(xiàn)紅色熒光；DAPI熒光染料對細胞核進行標記，發(fā)出藍色熒光。在小鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)，F(xiàn)oxO3a和LC3蛋白呈現(xiàn)不同部位的表達分布，有的表達于胞質(zhì)，有的可見表達于胞核；與Control組比較，PTSD組海馬神經(jīng)細胞內(nèi)FoxO3a和LC3蛋白所呈現(xiàn)的綠色熒光和紅色熒光信號強度均較Control組明顯增強，且二者與DAPI疊加后的熒光強度也高于Control組(圖5)。

圖5 免疫熒光染色檢測兩組小鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)FoxO3a和LC3的表達情況(×400，n=6)A.海馬神經(jīng)細胞內(nèi)FoxO3a的熒光表達；B.海馬神經(jīng)細胞內(nèi)LC3的熒光表達

討 論

PTSD疾病診斷難、發(fā)生率高、病程長、療效差，是由刺激性事件引起的典型疾病之一，近年來成為了研究的熱點，目前對于PTSD的治療僅局限于心理、情緒方面的對癥治療，經(jīng)治療后患者的癥狀也很難完全消失，對于產(chǎn)生該問題的主要癥結(jié)在于PTSD的發(fā)病機制尚未完全闡明。許多因素影響到PTSD的發(fā)生，如存在精神障礙的家族史與既往史、童年時代的心理創(chuàng)傷(如遭受性虐待、10歲前父母離異)、性格內(nèi)向及有神經(jīng)質(zhì)傾向、創(chuàng)傷事件前后有其他負性生活事件、家境不好、軀體健康狀態(tài)欠佳等，這些現(xiàn)象目前還在深入的研究中[7～9]。

有研究表明，PTSD患者的海馬體積部分萎縮，提示PTSD發(fā)病過程中患者海馬神經(jīng)細胞發(fā)生了異常的損傷、死亡和丟失[10,11]。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，海馬部位存在有明顯的神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象[12]。國內(nèi)外研究者已經(jīng)證實PTSD后神經(jīng)細胞凋亡高峰并不發(fā)生在創(chuàng)傷刺激后的早期階段，說明PTSD后神經(jīng)細胞死亡為一長期、持續(xù)的繼發(fā)性損傷過程，但本病的發(fā)病機制尚未完全闡明。PTSD發(fā)病過程中海馬神經(jīng)細胞的異常丟失和死亡除了與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)外，是否同時存在其他損傷因素尚不明確。腦功能的預(yù)后與各種繼發(fā)性損傷密切相關(guān)，神經(jīng)細胞繼發(fā)性損傷可造成腦組織結(jié)構(gòu)與功能的進一步損害，是導(dǎo)致腦功能障礙的重要原因之一。反復(fù)發(fā)生的慢性刺激，可能通過一系列的病理生理變化、興奮性毒性等因素引起隨后的神經(jīng)細胞死亡和神經(jīng)功能紊亂，如運動、感覺、學(xué)習(xí)和記憶障礙[13,14]。

自噬現(xiàn)象是細胞內(nèi)一種正常的生理活動，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能方面起著重要作用，在神經(jīng)變性疾病中，自噬受損可能導(dǎo)致神經(jīng)細胞的損傷[15]。在多數(shù)細胞正常情況下，自噬處于相當(dāng)?shù)偷乃?，但?dāng)機體處于刺激狀態(tài)時，體內(nèi)細胞的自噬可以被激活而呈現(xiàn)高水平，表現(xiàn)為自噬增強。當(dāng)機體和體內(nèi)的細胞遭受的刺激過多、程度過強時，自噬可以被過度激活，從而引起不可逆的細胞死亡，對機體造成損害，引起相關(guān)疾病的發(fā)生。

本研究通過SPS刺激方法建立PTSD小鼠模型，采用曠場實驗、高架十字迷宮實驗、Morris水迷宮實驗檢測SPS刺激后小鼠的行為學(xué)變化。曠場實驗是檢測動物焦慮水平的經(jīng)典行為學(xué)方法，用來評定動物的警覺水平、焦慮狀態(tài)和環(huán)境適應(yīng)能力。本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPS刺激后小鼠的活動總路程明顯減少，反映遭受刺激后小鼠對新環(huán)境的好奇感減弱，探索興趣下降，同時，觀察到小鼠常蜷縮在曠場箱體的角落旁，中央?yún)^(qū)域活動路程和停留時間減少，反映小鼠對開闊曠場環(huán)境保持警覺和害怕的心理。高架十字迷宮是檢測動物焦慮和恐懼水平的實驗設(shè)備，本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPS刺激后小鼠傾向于活動在兩側(cè)閉臂內(nèi)，并喜好躲藏在閉臂角落處，反映遭受刺激后小鼠對重新體驗創(chuàng)傷情景(高懸開臂危險)的回避，表現(xiàn)出恐懼水平較高，有明顯的焦慮樣行為。Morris水迷宮是檢測動物空間學(xué)習(xí)和記憶能力的首選經(jīng)典實驗，逃避潛伏期是站臺隱蔽試驗中的重要檢測指標，是反映小鼠尋找水下隱蔽站臺所花費的時間，這個指標用時越短說明小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力越強，相反則說明小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。小鼠穿越原站臺的次數(shù)和原站臺目標象限的停留時間，這兩個指標主要反映小鼠在較長時間內(nèi)的記憶保持能力。本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPS刺激后小鼠找到站臺的時間明顯延長，運動軌跡紊亂，沒有定向?qū)ふ艺九_的目的性，表明SPS刺激后小鼠的空間定位能力減弱，學(xué)習(xí)記憶能力受損。綜合以上行為學(xué)結(jié)果可知，SPS刺激后小鼠表現(xiàn)出PTSD疾病的主要核心癥狀，即焦慮和恐懼水平提高，環(huán)境適應(yīng)減弱，探索興趣下降，逃避反應(yīng)延遲，學(xué)習(xí)記憶能力下降。

近年來對FoxO3a的作用機制研究逐漸從腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到了神經(jīng)細胞，F(xiàn)oxO3a在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a 在缺血引起的神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，可作為治療海馬神經(jīng)損傷及認知障礙的靶向基因[16]。在小鼠神經(jīng)干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a基因還參與了促進神經(jīng)細胞的分化[17]。在運動性神經(jīng)疾病中，F(xiàn)oxO3a發(fā)揮神經(jīng)保護作用，細胞核內(nèi)FoxO3a的激活可以抑制由興奮性神經(jīng)毒素的表達引起的神經(jīng)細胞死亡[18]。研究還發(fā)現(xiàn)，刺激引起的神經(jīng)細胞損傷，其損傷程度在大腦不同細胞與區(qū)域間有差異，其中海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞尤其易受損傷,且隨著年齡增長而加劇。Jackson等[19]研究認為，CA1區(qū)的易損性與FoxO3a在CA1區(qū)大量表達有關(guān)。

FoxO3a具有磷酸化和非磷酸化兩種形式，其中非磷酸化形式的FoxO3a被認為具有轉(zhuǎn)錄激活活性分子，磷酸化在其活性及細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移作用中起到關(guān)鍵作用，F(xiàn)oxO3a是PI3K/Akt信號通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細胞應(yīng)激研究中，當(dāng)Akt磷酸化水平被抑制時，無法激活磷酸化的FoxO3a，使其與胞核輸出蛋白14-3-3特異性結(jié)合受阻，導(dǎo)致FoxO3a在胞核內(nèi)大量表達，從而增加細胞自噬[20]。同時，在本研究PTSD小鼠模型中，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SPS刺激后小鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)p-Akt水平隨時間延長表達下降，p-FoxO3a水平表達受阻，同時，觀察到LC3和FoxO3a蛋白水平增加，熒光表達強度增強，結(jié)果提示PTSD疾病神經(jīng)細胞自噬發(fā)生中可能存在FoxO3a的表達。但是由于PTSD后神經(jīng)細胞自噬的具體作用機制相當(dāng)復(fù)雜，F(xiàn)oxO3a與神經(jīng)細胞自噬之間的關(guān)系仍有待于進一步研究。