閆慧 徐慶科 高洪瑞 潘洋 郝巖 李健

[摘要] 目的 研究褪黑素（MT）對黃曲霉毒素B1（AFB1）誘導大鼠心肌損傷的作用及其相關(guān)機制。

方法將成年雄性健康SD大鼠隨機分為對照組、AFB1組和AFB1+MT組。對照組大鼠給予溶媒溶液灌胃，AFB1組和AFB1+MT組大鼠連續(xù)6周每天給予AFB1溶液（0.3 mg/kg）灌胃制備大鼠心肌損傷模型，AFB1+MT組大鼠在每天AFB1灌胃前半小時給予MT溶液（5 mg/kg）灌胃。連續(xù)灌胃6周后，腹主動脈取血制備血清，比較3組大鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶-MB（CK-MB）的水平;取大鼠心臟組織，應用酶標儀檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）的含量，采用Western blot法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表達;大鼠心臟組織切片后行TUNEL染色標記凋亡的心肌細胞。

結(jié)果 與對照組比較，AFB1組大鼠的血清LDH和CK-MB水平及心臟組織MDA含量均升高，抗氧化酶SOD、CAT活性降低;AFB1+MT組大鼠的血清CK-MB、LDH水平及心臟組織MDA含量低于AFB1組，SOD、CAT活性得到恢復，差異均有顯著意義（F=5.63～17.75，P<0.05）。Western blot和TUNEL染色結(jié)果顯示，MT預處理可下調(diào)caspase-3蛋白的表達，降低AFB1誘導的心肌細胞凋亡（F=8.98～11.94，P<0.05）。

結(jié)論 MT可能通過減輕氧化應激、下調(diào)caspase-3的表達、抑制細胞凋亡改善AFB1誘導的心肌損傷。

[關(guān)鍵詞] 褪黑激素;黃曲霉毒素B1;心肌損傷;細胞凋亡;氧化性應激;大鼠

[中圖分類號] R347

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0411-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.018

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200806.1723.002.html;2020-08-07 11：03：42

ROLE AND MECHANISM OF MELATONIN IN RATS WITH MYOCARDIAL INJURY INDUCED BY AFLATOXIN B1

YAN Hui， XU Qingke， GAO Hongrui，? PAN Yang， HAO Yan， LI Jian

（Department of Cardiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the role and mechanism of melatonin （MT） on aflatoxin B1 （AFB1）-induced myocardial injury in rats.

Methods Healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group， AFB1 group， and AFB1+MT group. The rats in the control group were given solvent solution by gavage， and those in the AFB1 group and the AFB1+MT group were given AFB1 solution at a dose of 0.3 mg/（kg·d） by gavage for 6 consecutive weeks to establish a rat model of myocardial injury; in addition， the rats in the AFB1+MT group were given MT solution （5 mg/kg） by gavage? half an hour before the administration of AFB1. After 6 consecutive weeks of intragastric administration， blood was collected from the abdominal aorta to prepare the serum， and the three groups were compared in terms of the serum levels of lactate dehydrogenase （LDH） and creatine kinase-MB （CK-MB）; heart tissue was collected， and a microplate reader was used to measure the activities of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） and the content of malondialdehyde （MDA）; Western blot was used to measure the protein expression of caspase-3; heart tissue sections were prepared and TUNEL staining was used to observe apoptotic cells.

Results Compared with the control group， the AFB1 group had significant increases in the serum levels of LDH and CK-MB and the content of MDA in heart tissue， as well as significant reductions in the activities of SOD and CAT; compared with the AFB1 group， the AFB1+MT group had significantly lower serum levels of CK-MB and LDH and content of MDA in heart tissue， as well as significant recovery of the activities of SOD and CAT （F=5.63-17.75，P<0.05）. Western blot and TUNEL staining showed that MT pretreatment downregulated the protein expression of caspase-3 and reduced cardiomyocyte apoptosis induced by AFB1 （F=8.98-11.94，P<0.05）.

Conclusion MT can significantly improve myocardial injury induced by AFB1， possibly by redu-

cing oxidative stress， downregulating the expression of caspase-3， and inhibiting apoptosis.

[KEY WORDS]melatonin; aflatoxin B1; myocardial injury; apoptosis; oxidative stress; rats

黃曲霉毒素主要由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生[1]。作為迄今為止人類所知的毒性最強的食品污染物之一，黃曲霉毒素B1（AFB1）進入人體后，可誘導組織損傷[2]。AFB1誘導組織損傷的機制十分復雜，其中氧化應激被認為是其產(chǎn)生毒性的重要基礎(chǔ)[3]。氧化應激是凋亡的重要調(diào)節(jié)信號[4]。凋亡又稱為程序性細胞死亡，是一種細胞自主性自身破壞的死亡形式，可引起細胞形態(tài)改變、DNA斷裂和凋亡小體形成[5-6]。WANG等[7]研究表明，AFB1可誘導產(chǎn)生過量的活性氧（ROS），觸發(fā)氧化應激并誘導心肌細胞凋亡。因此，有必要找到安全有效的天然抗氧化劑，以預防或減輕AFB1誘導的心肌損傷。褪黑素（MT）是一種由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律、抗氧化的作用[8-9]。MT可以很容易地進入細胞和亞細胞區(qū)室，從而在減輕氧化應激方面優(yōu)于其他抗氧化劑[10]。近年來的研究表明，MT對由氧化應激水平升高誘發(fā)的多種心臟疾病均具有治療作用，如心肌缺血/再灌注性損傷、糖尿病性心肌病等[11-12]。但關(guān)于MT干預黃曲霉毒素誘發(fā)的心肌損傷少見報道。因此，本研究構(gòu)建AFB1所致大鼠心肌損傷模型，并給予MT干預，探討MT對AFB1心肌毒性的改善作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

成年雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量約150 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK（魯）20140007。MT為Sigma公司產(chǎn)品;AFB1購于上海誠竺生物科技有限公司;抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）抗體和抗β-action抗體均由美國Abcam公司提供;超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）以及TUNEL試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶-MB（CK-MB）試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;DAB染色液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;BCA試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 適應性喂養(yǎng)1周后，將大鼠將隨機分為對照組（A組）、AFB1組（B組）和AFB1+MT組（C組），每組5只。AFB1+MT組大鼠給予MT溶液（5 mg/kg，溶于乙醇生理鹽水中）每天1次灌胃，與此同時對照組和AFB1組大鼠給予等量的乙醇生理鹽水灌胃。MT給藥后半小時，AFB1組和AFB1+MT組大鼠給予AFB1溶液（0.3 mg/kg）灌胃，對照組大鼠給予等量的含有二甲基亞砜的蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃6周。

1.2.2 標本采集 連續(xù)6周胃插管給藥后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血并迅速取出心臟組織。大鼠心臟被分為3等份，分別接受如下處理：①立即制備心臟組織勻漿液，檢測SOD、CAT和MDA的水平;②在液氮中速凍并保存于-80 ℃冰箱中待進行蛋白質(zhì)提取和分析;③用40 g/L甲醛固定備分析細胞凋亡。

1.2.3 血清LDH、CK-MB水平的測定 從大鼠的腹主動脈采集血樣，先在室溫下靜置30 min，再以3 000 r/min在4 ℃下離心10 min分離血清。根據(jù)試劑盒的說明，采用免疫抑制法測定血清CK-MB水平，采用微板法測定血清LDH水平。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 心臟組織MDA含量和SOD、CAT活性的測定 稱取新鮮大鼠心臟組織，制備100 g/L勻漿液，在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中，按照試劑盒說明書，利用各自的底物進行酶促反應并測量吸光度，計算心臟組織中MDA、SOD和CAT的表達水平。實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 Western blot檢測caspase-3的表達 將100 mg的冷凍大鼠心臟組織置于1 L含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中充分裂解，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，提取組織總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度。應用125 g/L的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白（60 mg），轉(zhuǎn)膜，封閉，加入兔源一抗（caspase-3，1∶500;β-actin，1∶10 000），于4 ℃下孵育過夜，洗滌3次后在室溫下再加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育2 h。最后用TBST洗滌3次，通過增強化學發(fā)光（ECL）法使目標條帶顯色，并使用Image J軟件分析其灰度值。目標蛋白的相對表達水平=目標蛋白條帶的灰度值/β-action條帶的灰度值。實驗重復3次，取平均值。

1.2.6 TUNEL染色檢測細胞凋亡 每個樣本隨機取5張切片，用體積分數(shù)0.03的過氧化氫封閉后，按試劑盒說明書對心臟石蠟切片進行TUNEL染色，以PBST洗片，DAB染色。在光鏡下觀察凋亡的心肌細胞（細胞核呈黃棕色者），應用Image-Pro Plus 6.0 軟件對細胞進行計數(shù)。計算凋亡率（凋亡細胞與每個區(qū)域中總細胞的百分比）。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所得結(jié)果以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;兩個變量之間的相關(guān)性評估采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)? 果

2.1 各組大鼠心臟損傷血清指標的比較

各組大鼠血清CK-MB、LDH水平存在明顯差異（F=16.60、17.75，P<0.01）。與對照組相比，AFB1組大鼠血清中心肌損傷標志物CK-MB和LDH的水平明顯升高（t=5.14、5.91，P<0.01），而AFB1+MT組大鼠的血清CK-MB、LDH水平較AFB1組顯著降低（t=3.06、3.61，P<0.01）。見表1。

與A組相比，*t=5.14、5.91，P<0.01;與B組相比，#t=3.06、3.61，P<0.01。

2.2 各組大鼠心臟組織MDA含量及SOD、CAT活性的比較

與對照組相比較，AFB1組大鼠心臟組織勻漿液中MDA含量顯著升高，抗氧化酶SOD和CAT的活性顯著降低;與AFB1組相比，AFB1+MT組大鼠MDA含量明顯下降，SOD和CAT的活性明顯升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=5.63～17.12，t=2.44～5.50，P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠心臟組織caspase-3蛋白表達比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、AFB1組和AFB1+MT組心臟組織caspase-3蛋白相對表達水平分別為1.00±0.25、3.45±0.70、2.07±0.76。AFB1組大鼠心臟組織caspase-3蛋白的表達水平較對照組顯著增加（F=11.94，t=4.87，P<0.01），AFB1+MT組大鼠心臟組織caspase-3蛋白的表達顯著低于AFB1組（t=2.74，P<0.05）。見圖1。

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率的比較

TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，AFB1組大鼠心肌細胞凋亡明顯增加（F=8.98， t=4.16，P<0.01），但MT預處理使心肌細胞的凋亡受到了抑制（t=2.29，P<0.05）。見圖2。

2.5 大鼠心臟組織中caspase-3與氧化應激指標的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，AFB1+MT組大鼠心臟組織中caspase-3的表達水平與MDA含量呈顯著正相關(guān)（r=0.857，P<0.05），而與SOD和CAT的酶活性呈顯著負相關(guān)（r=-0.845、-0.732，P<0.05）。

3 討? 論

AFB1是已知最危險的真菌毒素，攝入這種毒素能夠引起心臟損傷[13-14]。本研究采用AFB1溶液（0.3 mg·kg-1·d-1）灌胃構(gòu)建大鼠心肌損傷模型，顯示AFB1組大鼠血清中心肌損傷標志物CK-MB和LDH的水平明顯升高，說明大鼠心肌損傷模型制備成功;與AFB1組相比，MT給藥后AFB1+MT組血清CK-MB、LDH水平顯著降低。本研究結(jié)果首次證明，MT的應用可以有效地挽救暴露于AFB1所致的心肌損傷。為明確MT對AFB1引起的大鼠心肌損傷的保護作用及機制，本研究進一步檢測了各組大鼠的心臟氧化應激指標和心肌細胞凋亡程度。

相關(guān)研究表明，AFB1可誘導細胞產(chǎn)生大量的ROS，進一步破壞膜質(zhì)和DNA的結(jié)構(gòu)，并抑制其修復而引起氧化應激[15-16]。正常情況下機體的氧化和抗氧化能力處于平衡狀態(tài)，任何增強氧化作用或降低抗氧化能力的因素均可打破這一平衡，致細胞內(nèi)ROS過量積累，進而引起細胞氧化損傷[17-18]。其中，脂質(zhì)過氧化被認為是氧化損傷的主要指標之一，主要表現(xiàn)為MDA含量的增加。MT是目前已知的最為強效的抗氧化劑之一[19]。對大鼠肝臟的研究結(jié)果顯示，MT可以顯著恢復谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、SOD和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）等抗氧化酶的活性，有效減輕AFB1誘導的肝臟氧化損傷[20-21]。

這些抗氧化酶共同參與機體抗氧化防御系統(tǒng)的形成，其中，SOD可催化氧自由基生成H2O2，進一步在GPx和CAT的催化下分解為水和氧[22-23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)AFB1處理后，大鼠心臟組織勻漿液中MDA的含量顯著升高，抗氧化酶SOD和CAT的活性顯著降低，與以往的報道一致[13];AFB1+MT組與AFB1組相比，MDA含量明顯下降，組織抗氧化酶活性明顯升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義，表明MT通過增強組織抗氧化能力來減輕AFB1誘導的心臟氧化損傷。

我們的前期研究證實，AFB1引起的心臟損傷與心肌細胞的凋亡有關(guān)[24]。細胞凋亡過程需要多種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的參與，其中，caspase-3是凋亡執(zhí)行過程中最主要的蛋白，并在AFB1暴露的心肌細胞中異常表達，最終導致細胞的死亡[7， 24]。氧化應激被認為是凋亡的重要調(diào)節(jié)信號[25]。線粒體功能障礙與氧化應激誘導的凋亡過程密切相關(guān)，線粒體通透性的增加導致細胞色素C的釋放增多，胞質(zhì)中游離的細胞色素C可通過激活caspase-9而激活下游的caspase-3，最終導致凋亡的發(fā)生[26-28]。因此，氧化應激的抑制可能對AFB1誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用。MEKI等[21]研究表明，MT通過改善氧化應激，下調(diào)caspase-3蛋白的表達，減輕AFB1誘導的肝細胞凋亡，從而保護肝臟組織免受AFB1的毒性損傷。目前，關(guān)于MT對AFB1細胞毒性的保護作用的研究尚僅限于消化和生殖系統(tǒng)[29-30]，而其與心臟有關(guān)的報道很少。

本研究TUNEL染色顯示，AFB1可使大鼠心肌細胞凋亡率明顯增加，而給予MT預處理則顯著抑制了AFB1誘導的心肌細胞凋亡;Western blot檢測結(jié)果也顯示，MT可以顯著降低AFB1誘導的caspase-3的活化，而caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，說明MT可能是通過下調(diào)caspase-3蛋白的表達來減輕AFB1的心肌毒性。進一步的相關(guān)分析顯示，大鼠心臟組織中caspase-3的表達水平與MDA含量呈正相關(guān)，而與SOD和CAT的酶活性呈負相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，MT保護大鼠心臟免受AFB1的毒性損傷，其機制可能與抑制氧化應激、下調(diào)caspase-3的表達，進而減少心肌細胞的異常凋亡有關(guān)。

綜上所述，氧化應激是AFB1心肌毒性的主要表現(xiàn)之一，最終導致心肌細胞的凋亡。作為人類可自身分泌的內(nèi)源性激素，MT具有強大的抗氧化能力，且安全無毒性。本研究結(jié)果表明，MT可以減輕AFB1誘導的心臟損傷，該作用可能是通過改善心肌抗氧化能力、抑制caspase-3蛋白的表達、降低心肌細胞凋亡實現(xiàn)的，這為AFB1心臟毒性的治療提供了新的方法。

[參考文獻]

[1]ADEPO J A， MANDA P， NGBE J V，? et al.? Study of aflatoxicosis reduction： effect of Alchornea cordifolia on biomarkers in an aflatoxin B1 exposed rats[J].? Drug and Chemical Toxicology， 2019，42（3）：243-251.

[2]BAAN R， GROSSE Y， STRAIF K，? et al.? A review of human carcinogens-Part F： chemical agents and related occupations[J].? Lancet Oncol， 2009，10（12）：1143-1144.

[3]SOUZA M F， TOM A R， RAO V S N. Inhibition by the bioflavonoid ternatin of aflatoxin B1-induced lipid peroxidation in rat liver[J].? Journal of Pharmacy and Pharmacology， 1999，51（2）：125-129.

[4]REDZA-DUTORDOIR M， AVERILL-BATES D A. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species[J].? Biochimica et Biophysica Acta， 2016，1863（12）：2977-2992.

[5]LOCKSHIN R A， ZAKERI Z. Programmed cell death and apoptosis： origins of the theory[J].? Nat Rev Mol Cell Biol， 2001，2（7）：545-550.

[6]KHADER S Z A， SYED ZAMEER AHMED S， GANESAN G M，? et al.? Rhynchosia rufescens AgNPs enhance cytotoxicity byROS-mediated apoptosis in MCF-7 cell lines[J].? Environmental Science and Pollution Research， 2020，27（2）：2155-2164.

[7]WANG W J， XU Z L， YU C，? et al.? Effects of aflatoxin B1 on mitochondrial respiration， ROS generation and apoptosis in broiler cardiomyocytes[J].? Animal Science Journal， 2017，88（10）：1561-1568.

[8]VISHNOI S， RAISUDDIN S， PARVEZ S. Glutamate excitotoxicity and oxidative stress in epilepsy： modulatory role of melatonin[J].? Journal of Environmental Pathology， Toxicology and Oncology， 2016，35（4）：365-374.

[9]冉雯雯，孫顯露，朱宗令，等. 褪黑素對慶大霉素急性腎損傷保護作用的研究[J].? 青島大學醫(yī)學院學報， 2007，43（3）：192-195.

[10]RAMIS M， ESTEBAN S， MIRALLES A，? et al.? Protective effects of melatonin and mitochondria-targeted antioxidants against oxidative stress： a review[J].? Current Medicinal Che-

mistry， 2015，22（22）：2690-2711.

[11]ZHAI M G， LI B Y， DUAN W X，? et al.? Melatonin ameliorates myocardial ischemia reperfusion injury through SIRT3-dependent regulation of oxidative stress and apoptosis[J].? Journal of Pineal Research， 2017，63（2）：e12419.

[12]YU L M， DI W C， DONG X，? et al.? Melatonin protects diabe-tic heart against ischemia-reperfusion injury， role of membrane receptor-dependent CGMP-PKG activation[J].? Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular Basis of Disease， 2018，1864（2）：563-578.

[13]YILMAZ S， KAYA E， COMAKLI S. Vitamin E （α tocophe-rol） attenuates toxicity and oxidative stress induced by aflato-xin in rats[J].? Adv Clin Exp Med： Off Organ Wroclaw Med Univ， 2017，26（6）：907-917.

[14]YILMAZ S， KAYA E， KARACA A，? et al.? Aflatoxin B1 induced renal and cardiac damage in rats： protective effect of lycopene[J].? Research in Veterinary Science， 2018，119：268-275.

[15]LIU Y， WANG W J. Aflatoxin B1 impairs mitochondrial functions， activates ROS generation， induces apoptosis and involves Nrf2 signal pathway in primary broiler hepatocytes[J].? Animal Science Journal， 2016，87（12）：1490-1500.

[16]CHOUDHARY A， VERMA R J. Ameliorative effects of black tea extract on aflatoxin-induced lipid peroxidation in the liver of mice[J].? Food and Chemical Toxicology， 2005，43（1）：99-104.

[17]馬璐，陳麗萍，陳雯. 表觀遺傳修飾在氧化-抗氧化平衡調(diào)控中的改變及作用[J].? 醫(yī)學分子生物學雜志， 2014，36（4）：218-222.

[18]REN Q， XIE H， CHEN Y Q，? et al.? Effect of micronutrient pack on micronutrient status and antioxidant capacities among institutional older adults in Shanghai， China[J].? Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition， 2019，28（3）：457-466.

[19]曾慶菊，李慧，王晉文. 褪黑素對糖尿病大鼠氧化應激及足細胞凋亡的影響及作用機制[J].? 昆明醫(yī)科大學學報， 2019，40（10）：62-66.

[20]MEKI A R， ABDELGHAFFAR S K， ELGIBALY I. Aflato-xin B1 induces apoptosis in rat liver： protective effect of melatonin[J].? Neuro Endocrinology Letters， 2001，22（6）：417-426.

[21]MEKI A R， ESMAIL EEL D， HUSSEIN A A，? et al.? Caspase-3 and heat shock protein-70 in rat liver treated with aflatoxin B1： effect of melatonin[J].? Toxicon， 2004，43（1）：93-100.

[22]JARIKRE T A， TAIWO J O， EMIKPE B O，? et al.? Protective effect of intranasal peste des petits ruminants virus and bacterin vaccinations： clinical， hematological， serological， and se-rum oxidative stress changes in challenged goats[J].? Vet World， 2019，12（7）：945-950.

[23]王貞麗，李丙華，姚如永，等. 海洋多肽對血管內(nèi)皮細胞氧化損傷保護作用及機制[J].? 青島大學學報（醫(yī)學版）， 2019，55（6）：652-656，660.

[24]GE J H， YU H C， LI J，? et al.? Assessment of aflatoxin B1 myocardial toxicity in rats： mitochondrial damage and cellular apoptosis in cardiomyocytes induced by aflatoxin B1[J].? Journal of International Medical Research， 2017，45（3）：1015-1023.

[25]ZHANG M， ZHU J Y， QIN X，? et al.? Cardioprotection of tetrahedral DNA nanostructures in myocardial ischemia-reperfusion injury[J].? ACS Applied Materials & Interfaces， 2019，11（34）：30631-30639.

[26]NEVES S P， CARVALHO N C， DA SILVA M M，? et al.? Ruthenium complexes containing heterocyclic thioamidates trigger caspase-mediated apoptosis through MAPK signaling in human hepatocellular carcinoma cells[J].? Frontiers in Oncology， 2019，9：562.

[27]WALLACH D， KANG T B， DILLON C P，? et al.? Programmed necrosis in inflammation： toward identification of the effector molecules[J].? Science， 2016，352（6281）：aaf2154.

[28]MARTNEZ M A， ARES I， RODRGUEZ J L，? et al.? Pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin induces hepatic cytochrome P450 enzymes， oxidative stress and apoptosis in rats[J].? Science of the Total Environment， 2018，631-632：1371-1382.

[29]AKINRINMADE F J， AKINRINDE A S， AMID A. Changes in serum cytokine levels， hepatic and intestinal morphology in aflatoxin B1-induced injury： modulatory roles of melatonin and flavonoid-rich fractions from Chromolena odorata[J].? Mycotoxin Research， 2016，32（2）：53-60.

[30]CHENG L H， QIN Y S， HU X，? et al.? Melatonin protects in vitro matured porcine oocytes from toxicity of Aflatoxin B1[J].? Journal of Pineal Research， 2019，66（4）：e12543.

（本文編輯 馬偉平）