唐靖雯 潘 梅* 張麗艷 梁 斌 盧禮平

1.貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550018；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

花菊盆炎顆粒是利用貴州苗藥頭花蓼優(yōu)良的抗菌消炎活性特點(diǎn)，并結(jié)合中醫(yī)藥理論及名老中醫(yī)的臨床治療經(jīng)驗(yàn)，采用頭花蓼為君藥，配以野菊花、夏枯草、醋延胡索、茜草炭、三七、粉萆薢等六味中藥組成經(jīng)驗(yàn)方；由貴州威門藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)的一種治療女性慢性盆腔炎的純中藥復(fù)方制劑，屬于國家6類中藥新藥。頭花蓼中主要含有蘆丁、槲皮素等黃酮類成分，溶于乙醇，具有明顯的消炎、抗菌作用[1]；野菊花中主要含有萜類化合物、黃酮類化合物等，水提液具有明顯的抗菌、抗病毒、抗抑郁和消炎等作用[2]；夏枯草的主要成分為三萜及其苷類、苯丙素類、黃酮類、香豆素等，其水提液具有廣譜抗菌活性，消炎、鎮(zhèn)痛等作用[3]；延胡索中主要含異喹啉生物堿[4]，醋延胡索較生品有利于生物堿的溶出，且研究[5]表明60%乙醇提取效果最佳；茜草主要含有蒽醌及其苷類化合物，茜草炭水提取液有消炎、抗菌作用并能縮短小鼠的凝血時(shí)間[6]；三七中的主要有效成分為三七總皂苷，易溶于乙醇溶液[7]；粉萆薢中主要含有皂苷和甾體皂苷類化合物，皂苷和甾體皂苷類的成分易溶于水，且具有抗病原微生物、消炎等作用[8]；根據(jù)處方中各味藥物的有效成分及其理化性質(zhì)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，采用醇提與水提醇沉相結(jié)合的提取工藝。其中，頭花蓼、延胡索、三七采用乙醇提?。灰熬栈?、夏枯草、茜草炭、粉萆薢采用水提醇沉；以槲皮素總量、正丁醇浸出物為綜合考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)醇提、水提醇沉過程中的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)選，確定最佳的提取工藝,為花菊盆炎顆粒的批量生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，為臨床上治療慢性盆腔炎提供一種療效確切的新藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100型高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司)；AG135型十萬分之一電子天平(梅特勒托利多科技有限公司)；CH-250型超聲波清洗器(北京創(chuàng)新德超聲電子研究所)；101-5型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；SENCOR○R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；予華牌循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2 試藥 頭花蓼、野菊花、夏枯草等藥材購于貴州省藥材公司，所有藥材均符合《中國藥典》2000版(一部)或地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；花菊盆炎顆粒提取液(批號(hào)：040801、040802、040803)；槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：10081-9905，純度：96.5%，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正丁醇浸出物含量測(cè)定 取浸膏粉樣品約 2 g，精密稱定重量，置100 mL的錐形瓶中，精密加入正丁醇50 mL，塞緊，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，稱定重量，用正丁醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算樣品中浸出物的含量。

2.2 槲皮素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50，V/V)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.01 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取浸膏粉約0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，密塞，稱定重量，搖勻，水浴回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，濾過，精密量取續(xù)濾液 5 mL 置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

圖1 槲皮素高效液相色譜(HPLC)圖

2.3 提取工藝條件的優(yōu)選

2.3.1 頭花蓼、醋延胡索、三七藥材的醇提工藝研究 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，以影響提取工藝的主要因素乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，以測(cè)得的君藥頭花蓼中槲皮素總量及浸膏收率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。每個(gè)因素3個(gè)水平，用正交表L9(34)進(jìn)行優(yōu)選，正交試驗(yàn)因素水平見表2。優(yōu)選醇提工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

表3 方差分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，以槲皮素含量及浸膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，理論上的最佳提出工藝條件為A1B3C2D3，結(jié)合K值，根據(jù)表2方差分析結(jié)果表明，各因素作用的主次為D>A>C>B，并通過表3方差分析可知，A、C、D因素均具有極顯著性差異(P<0.01)。最終確定最佳的提取工藝條件為A1B2C2D3組合為佳，即加7倍量60%乙醇提取1.5 h，共提3次。

2.3.2 野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢藥材的水提工藝研究 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，以影響提取工藝的主要因素加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)為考察因素，以測(cè)得的正丁醇浸出物的總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每個(gè)因素3個(gè)水平，用正交表L9(34)進(jìn)行優(yōu)選，正交試驗(yàn)因素水平見表4。優(yōu)選水提工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 因素水平表

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

表6 方差分析

結(jié)果表明：由直觀分析可知，各因素作用的主次為C>A>B；并由方差分析結(jié)果可知，A、B因素對(duì)結(jié)果沒有顯著性影響(P>0.05)、C因素對(duì)結(jié)果具有顯著性影響(P<0.05)，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際成本考慮，以組合A3B1C3為佳，即加10倍量水提取1 h，共提3次。

2.3.3 野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢藥材的醇沉工藝研究 為了最大限度地除去水提液中的無效成分，盡可能地保留有效成分，本工藝采用醇沉的方法對(duì)水提液進(jìn)行精制。以浸膏相對(duì)密度(A)、醇沉濃度(B)兩個(gè)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選。按“2.3.2”項(xiàng)下水煎煮最佳工藝A3B1C3條件提取，將所得的濾液平均分為三份，每一份分別濃縮至相應(yīng)的密度后，按正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表7，結(jié)果見表8。

表7 因素水平表

表9 方差分析

由表8極差值大小顯示，各因素作用的主次為A>B；并由表9方差分析結(jié)果可知，A因素對(duì)結(jié)果具有極顯著性影響(P<0.01)，B因素具有顯著性影響(P<0.05)；以A2B2組合為佳，即浸膏的相對(duì)密度在1.10～1.15之間，醇沉?xí)r使藥液含醇量達(dá)70%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方稱取頭花蓼、醋延胡索、三七藥材各3份，對(duì)上述“2.3.1”項(xiàng)下確定的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表10；按處方稱取野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢藥材各3份，對(duì)上述“2.3.2”項(xiàng)下確定的水提工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表11，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)“2.3.3”項(xiàng)下確定的醇沉工藝進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果見表12。驗(yàn)證結(jié)果表明該提取工藝可行，可用于工業(yè)生產(chǎn)。

表10 頭花蓼等藥材的醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

表11 野菊花等藥材水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

表12 野菊花等藥材醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)性的選擇 處方中頭花蓼、醋延胡索、三七以60%乙醇提取，因頭花蓼具有良好抗菌、抗炎作用，與該制劑的功能主治一致，故以君藥頭花蓼中槲皮素作為醇提工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo),同時(shí)，考慮野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢中均含苷類成分，此類成分易溶于正丁醇中，因此，選擇正丁醇浸出物的總量作為水提醇沉提取物的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 按君藥頭花蓼現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[9]項(xiàng)下方法的流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，其槲皮素出峰時(shí)間較長(zhǎng)。本研究在該流動(dòng)相的基礎(chǔ)上改變其比例，經(jīng)摸索選定流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液(60∶40)分離效果較好，出峰時(shí)間短，且與其它成分無干擾；經(jīng)樣品峰純度檢查，證明為純峰，故以甲醇-0.4%磷酸溶液(60∶40)為流動(dòng)相。

3.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 該提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)中，分別對(duì)醇提、水提、醇沉工藝分別進(jìn)行驗(yàn)證，從各部分的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)該工藝穩(wěn)定、可行，后續(xù)研究將增加整個(gè)提取過程的最終驗(yàn)證試驗(yàn)，以便進(jìn)一步驗(yàn)證該工藝。

4 結(jié)論

根據(jù)處方中藥物性質(zhì)，本試驗(yàn)采用了乙醇提取法、水提醇沉法相結(jié)合的提取工藝。采用正交設(shè)計(jì)，以浸膏收率、槲皮素總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定醇提工藝為頭花蓼、醋延胡索、三七加7倍量60%乙醇提取3次，每次1.5 h，過濾得醇提液；以正丁醇浸出物總量、浸膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳水提醇沉工藝為野菊花、夏枯草、茜草炭、粉萆薢加10倍量的水煎煮3次、每次1 h，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15(60 ℃)的浸膏，放冷，加乙醇使藥液含醇量達(dá)70%，靜置后過濾，得水提醇沉液；合并上述濾液，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25(60 ℃)。