李紅梅，魏艷麗，扈進(jìn)冬，楊凱，劉寶軍，楊合同，李紀(jì)順

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生態(tài)研究所 山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103)

病原真菌引起的土傳病害能夠造成農(nóng)作物及設(shè)施瓜果蔬菜大面積減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)，且難以防治。由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰霉菌(Botrytiscinerea)等致病菌引起的土傳病害危害極大[1-3]，這些病原菌都能夠在土壤中以菌核、分生孢子或菌絲體越冬，如果上茬作物發(fā)病嚴(yán)重，需要對(duì)土壤進(jìn)行消毒后才能種植下茬，否則土傳病害會(huì)大面積發(fā)生，造成絕產(chǎn)。目前土壤消毒方法主要有物理消毒法和化學(xué)消毒法[4]，化學(xué)消毒法不但使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且容易造成土壤污染，而生產(chǎn)上常用的高溫燜棚等物理消毒方法易受季節(jié)影響。因此，亟需尋找一種綠色、高效的土壤處理方法。

臭氧是一種強(qiáng)氧化消毒劑，可殺滅各種微生物[5-6]，溶于水后具有更強(qiáng)的殺菌作用[7]，且臭氧水易于分解、無(wú)污染、廉價(jià)高效，是理想的新型殺菌劑。臭氧水對(duì)病原真菌的抑制和殺滅效果的研究多見于只針對(duì)一種病原真菌[8-10]，少數(shù)研究針對(duì)兩種病原真菌[11]，而針對(duì)3種及以上多種土傳病原真菌的研究較少。本研究利用臭氧水對(duì)3種土傳病原真菌進(jìn)行殺滅試驗(yàn)，篩選適宜的臭氧水質(zhì)量濃度及最佳作用時(shí)間，以期為土壤的綠色消毒技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

臭氧水發(fā)生器(山東澤恩農(nóng)業(yè)科技股份有限公司)；啟立DOZ-30臭氧濃度檢測(cè)儀(廣州啟立環(huán)保設(shè)備有限公司)。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

病原真菌(尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、灰霉菌)及深綠木霉20111(Trichodermaatroviride)均為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L， pH自然。

1.2 方法

1.2.1 真菌孢子懸浮液制備

將本實(shí)驗(yàn)室保藏的病原真菌尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、灰霉菌轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待有大量孢子產(chǎn)生時(shí)，刮取孢子至無(wú)菌生理鹽水中震蕩混勻，無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，濾液即為孢子懸浮液。

1.2.2 臭氧水對(duì)真菌孢子的殺滅試驗(yàn)

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1.2.3 臭氧水對(duì)土壤中病原真菌的殺滅試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的病原菌制備孢子懸浮液，并稀釋到一定質(zhì)量濃度，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液與土壤混勻，調(diào)整土壤中孢子數(shù)為105cfu/g干土，作為病土裝入花盆(19 cm×16 cm)，1000 g/盆，澆灌臭氧水質(zhì)量濃度設(shè)為5 、10 mg/L，澆灌量500 mL/盆(以盆底有水流出為宜)，進(jìn)行以下處理：(1)對(duì)照CK，澆灌自來(lái)水；(2)處理T1，臭氧水澆灌1次；(3)處理T2，臭氧水澆灌2次，間隔5 d；(4)處理T3，臭氧水澆灌3次，各間隔5 d。每處理3個(gè)重復(fù)，處理結(jié)束后，取各處理土壤，采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)土壤進(jìn)行病原菌計(jì)數(shù)[12-14]，殺滅率按公式(1)計(jì)算。

1.2.4 臭氧水處理對(duì)接種尖孢鐮刀菌白菜幼苗的影響

將制備好的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液與土壤混勻至105cfu/g干土，裝入花盆(19 cm×16 cm)，1000 g/盆，澆灌臭氧水質(zhì)量濃度設(shè)為5 mg/L，澆灌量500 mL/盆，共澆灌3次，間隔5 d，處理如下：(1)對(duì)照CK，澆灌自來(lái)水；(2)臭氧處理：土壤澆灌臭氧水；(3)木霉處理：土壤澆灌自來(lái)水，白菜種子浸種木霉20111孢子懸浮液(濃度為4.3×105cfu/mL)；(4)臭氧處理+木霉處理：土壤澆灌臭氧水，白菜種子用木霉20111孢子液浸種(濃度同處理(3))。以上各處理3個(gè)重復(fù)，土壤濕度合適時(shí)進(jìn)行播種，常規(guī)管理。4周后調(diào)查白菜發(fā)病情況及株高、干重、葉綠素含量等生長(zhǎng)指標(biāo)，計(jì)算各處理的病株率和防治效果。

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1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan′s 方法進(jìn)行分析，結(jié)果為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 臭氧水對(duì)病原真菌孢子的殺滅作用

由圖1可知，各質(zhì)量濃度的臭氧水對(duì)3種病原真菌都有殺滅作用，在1.0～5.0 mg/L范圍內(nèi)，殺滅率隨臭氧水質(zhì)量濃度增加而增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，0.5 min內(nèi)對(duì)尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌及灰霉菌的殺滅率分別為70.4%、74.2%、72.7%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，殺滅率沒有明顯升高；當(dāng)質(zhì)量濃度上升到2.0 mg/L時(shí)，0.5 min內(nèi)對(duì)3種病原真菌的殺滅率分別為96.2%、97.5%、97.4%；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到5.0 mg/L時(shí)，0.5 min對(duì)3種病原真菌的殺滅率都達(dá)到100%?？梢姵粞跛|(zhì)量濃度顯著影響病原菌的殺滅率，而處理時(shí)間對(duì)殺滅率沒有顯著影響。

注：圖中不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。圖1 臭氧水對(duì)3種病原真菌孢子的殺滅效果Fig.1 The sterilizing effect of ozone water on the spores of the pathogenic fungi

2.2 臭氧水對(duì)土壤中病原真菌的殺滅作用

利用兩種質(zhì)量濃度的臭氧水對(duì)土壤中的3種病原真菌進(jìn)行滅菌處理，由圖2可以看出，當(dāng)臭氧水質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，對(duì)3種病原菌的殺滅率隨處理次數(shù)的增加而顯著增加；質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，處理2次、3次對(duì)3種病原真菌的殺滅率與處理1次差異顯著，而處理2次與3次之間差異不顯著。

注：圖中不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。圖2 臭氧水對(duì)土壤中病原真菌的殺滅效果Fig.2 The sterilizing effect of ozone water on the pathogenic fungi in soil

2.3 臭氧水處理對(duì)接種尖孢鐮刀菌白菜幼苗的影響

臭氧水處理接種病原菌的土壤后種植大白菜，結(jié)果如表1所示。臭氧水消毒土壤后，能顯著降低白菜枯萎病的發(fā)病率，臭氧處理和臭氧+木霉處理發(fā)病率降低至2.5%和6.25%，與對(duì)照以及木霉處理間存在顯著差異。臭氧水處理土壤后直接播種，對(duì)白菜幼苗的生長(zhǎng)有一定影響，植株明顯矮小，株高和單株干重與其他處理間差異顯著。木霉浸種處理能有效緩解臭氧水消毒土壤后對(duì)植株的影響，其株高和干重都與對(duì)照無(wú)顯著差異。臭氧水處理土壤后白菜幼苗葉片的葉綠素含量不受影響，各處理間無(wú)顯著差異。

表1 臭氧水處理對(duì)白菜幼苗的影響

3 討論

臭氧水殺菌作用強(qiáng)，可殺滅各種微生物。本文用臭氧水處理105數(shù)量級(jí)的真菌孢子懸浮液，當(dāng)臭氧水質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，0.5 min內(nèi)對(duì)3種病原菌孢子的殺滅率在70.4%～74.2%；當(dāng)臭氧水質(zhì)量濃度上升為2 mg/L時(shí)，0.5 min的殺滅率迅速升高到96.2%～97.4%。而作用時(shí)間對(duì)殺滅率無(wú)顯著影響，可見質(zhì)量濃度是影響臭氧水殺菌效果的關(guān)鍵因素，這與已報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果[15]一致。

臭氧水對(duì)土壤中3種病原真菌的殺滅試驗(yàn)表明，5 mg/L的臭氧水處理3次與10 mg/L的臭氧水處理2次都能達(dá)到很好的殺菌效果。實(shí)際生產(chǎn)中高濃度臭氧水不易獲得，所以采用多次澆灌的方法能有效防治土壤病蟲害。

臭氧對(duì)微生物的殺滅作用無(wú)選擇性，所以對(duì)土壤處理后有益微生物菌群會(huì)受到破壞。本試驗(yàn)中臭氧處理的白菜幼苗生長(zhǎng)受到影響，植株明顯矮小，株高和單株干重都與其他處理差異顯著，而添加木霉處理的植株不受影響，株高和單株干重都與對(duì)照無(wú)顯著差異，這可能是木霉的施入明顯改善了土壤消毒后的有益菌群，使植株健康生長(zhǎng)。有報(bào)道稱植株在生長(zhǎng)期進(jìn)行臭氧水澆灌，能顯著提高葉片的葉綠素含量、SPAD值[16-17]，本試驗(yàn)中，種植前土壤澆灌臭氧水，各處理間的葉綠素含量無(wú)顯著差異，這可能與臭氧水澆灌時(shí)間以及臭氧水質(zhì)量濃度有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，臭氧水澆灌可作為土壤綠色消毒技術(shù)，但消毒后需要添加有益微生物來(lái)重建土壤中的微生物生態(tài)系統(tǒng)，以達(dá)到植株健康生長(zhǎng)的目的。