莫彩蓮，李杰，王加珍，劉鑫，林圣華，牟艷玲， 張?jiān)?，劉可?，何秋霞*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所 山東省人類(lèi)疾病斑馬魚(yú)模型與藥物篩選工程技術(shù)研究中心， 山東 濟(jì)南 250014; 2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062)

血栓性疾病具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[1]。在血栓性疾病的研究過(guò)程中，已經(jīng)建立了許多動(dòng)物血栓模型。兔、犬、貓、小型豬動(dòng)物血栓模型存在實(shí)驗(yàn)成本高、飼養(yǎng)空間占有率大、對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷大和術(shù)后管理困難等問(wèn)題，易導(dǎo)致非血栓性死亡。大鼠、小鼠動(dòng)物血栓模型由于其體型較小，操作技術(shù)要求高，且在建造某些血栓模型中血栓形成率低，不穩(wěn)定，存在形成的血栓易溶栓等問(wèn)題。傳統(tǒng)的動(dòng)物血栓模型雖然已經(jīng)研究多年，但誘導(dǎo)形成的動(dòng)物血栓模型與人類(lèi)病理性血栓還存在很多差異。因此建立與臨床病理生理機(jī)制相似的血栓模型對(duì)于抗栓藥物的研究是十分必要的[2]。

斑馬魚(yú)(Daniorerio)因其胚胎小、水生環(huán)境和小分子滲透性強(qiáng)等特點(diǎn)，成為一個(gè)備受青睞的用于高通量藥物篩選的模式動(dòng)物。與線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、鼠等其他模式生物相比，斑馬魚(yú)與人器官在結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面驚人地相似，和人類(lèi)的基因組保守性很高，基因組同源性87%。在蛋白質(zhì)水平上，關(guān)鍵部位的同源性幾乎是100%。斑馬魚(yú)血液對(duì)凝血?jiǎng)?如膠原和ADP)和抗凝血?jiǎng)?如阿司匹林和殺鼠靈warfarin)的反應(yīng)與人類(lèi)血液相似，在人類(lèi)血栓癥中起重要作用的幾個(gè)基因已經(jīng)通過(guò)序列同源性在斑馬魚(yú)中找到[3-5]。國(guó)內(nèi)外利用斑馬魚(yú)以及其突變體已建立了多種人類(lèi)疾病模型，如抗新生血管形成、腫瘤、血液疾病、細(xì)胞凋亡和增殖、脂質(zhì)代謝、炎癥和中樞耐受等[6-7]，并開(kāi)展了相關(guān)的藥物篩選評(píng)價(jià)研究工作。

在血栓形成過(guò)程中起核心作用的是血小板的活化。血小板是一種多功能細(xì)胞，具有黏附、聚集和釋放功能，并且有較強(qiáng)的促凝活性，在血栓形成與止血過(guò)程中起重要作用。許多血栓性疾病都有血小板聚集釋放功能亢進(jìn)，微循環(huán)血小板聚集增多現(xiàn)象。抑制血小板聚集性的異常發(fā)生，對(duì)心腦血管性疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治都有重要的意義[8]。我國(guó)擁有極為豐富的中藥材資源，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的先導(dǎo)化合物已經(jīng)成為新藥研究的一個(gè)重要途徑。本研究在建立斑馬魚(yú)血栓模型中，選擇20種中藥成分單體，分別利用斑馬魚(yú)模型和血小板模型檢測(cè)其對(duì)血小板聚集的影響，研究了斑馬魚(yú)模型在中藥成分活性評(píng)價(jià)中的適用性。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

中藥對(duì)照品葛根素(批號(hào)20051322，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、甘草次酸(批號(hào)18121241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、銀杏內(nèi)酯A(批號(hào)19062716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、銀杏內(nèi)酯B(批號(hào)19032631，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、桃葉珊瑚苷(批號(hào)19010241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、姜黃素(批號(hào)19072423，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、苦參堿(批號(hào)19072636，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、金絲桃苷(批號(hào)19062525，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、紅景天苷(批號(hào)20070222、質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、綠原酸(批號(hào)20031535，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、虎杖苷(批號(hào)19080241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、甘草苷(批號(hào)19041032，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、莽草酸(批號(hào)19071935，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、銀杏內(nèi)酯C(批號(hào)19112641，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、黃芪甲苷(批號(hào)19091023，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、芍藥苷(批號(hào)19071131，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、大豆苷元(批號(hào)20022611，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、大豆苷(批號(hào)20040906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、防己諾林堿(批號(hào)20070344，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%)、鹽酸黃連堿(批號(hào)19042341，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，均購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；低分子肝素購(gòu)自Sigma公司；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；三氯化鐵購(gòu)自天津化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

COIC-ZSA302 型體視顯微鏡；X51 型倒置顯微鏡；SZX16 型體視熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；PACKS-4 型血小板聚集儀(美國(guó)Helena公司)。

1.3 動(dòng)物

野生型AB 系斑馬魚(yú)和TG系( integrin αIIb∶EGFP)血小板標(biāo)記綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)均由本實(shí)驗(yàn)室提供；清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重(250±20)g，山東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK-(魯)-2019-0001。

2 方法

2.1 斑馬魚(yú)胚胎收集

2.2 樣品溶液配制

2.2.1 中藥對(duì)照品

稱(chēng)取中藥對(duì)照品，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中獲得100 mg/mL 樣品儲(chǔ)存液，再用胚胎培養(yǎng)用水稀釋至不同質(zhì)量濃度，并保證篩選體系中DMSO 體積分?jǐn)?shù)不高于 0.5%[9]。

2.2.2 三氯化鐵

用純凈水配成100 mg/L儲(chǔ)存液，用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)用水稀釋成不同濃度的三氯化鐵應(yīng)用溶液。

2.3 中藥對(duì)照品處理方法

斑馬魚(yú)受精發(fā)育天數(shù)(days post fertilization，dpf)為4 d時(shí)，在體視倒置顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)仔魚(yú)，移入24 孔板的樣孔中，每孔5條。樣孔中已預(yù)先加入新配好的中藥對(duì)照品溶液 (10、20、40 μg/mL)，對(duì)照組為胚胎培養(yǎng)用水，隨后加蓋封閉，置于光照培養(yǎng)箱(28 ℃)內(nèi)，讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。

2.4 血栓形成檢測(cè)

斑馬魚(yú)血栓細(xì)胞在3 dpf開(kāi)始進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，到5 dpf發(fā)育成熟。4 dpf斑馬魚(yú)仔魚(yú)經(jīng)受試藥品孵育24 h后，向各組加入2×10-6mol/L的三氯化鐵，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察TG熒光斑馬魚(yú)腸下腹主動(dòng)脈血小板凝集，在倒置顯微鏡下觀察記錄腸下腹主動(dòng)脈血管阻塞時(shí)間。

2.5 血小板血漿制備

2.6 抗血小板聚集體外實(shí)驗(yàn)

將中藥單體按終濃度的10倍配制后，取20 μL 溶液加入含PRP 180 μL 管中，置于37 ℃ 孵育2 min。由PPP 調(diào)零后，用微量進(jìn)液器在不同比色杯中加入20 μL二磷酸腺苷(ADP)，按比濁法[11]用血液聚集儀記錄5 min內(nèi)的聚集曲線(xiàn)，用聚集曲線(xiàn)面積來(lái)表示體外血小板的最大聚集率，并計(jì)算中藥單體抑制血小板聚集的聚集抑制率。聚集抑制率=(對(duì)照管最大聚集率-實(shí)驗(yàn)管最大聚集率)÷對(duì)照管最大聚集率×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照組與加藥組之間的比較用One-Way ANOVA分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 中藥材單體成分對(duì)斑馬魚(yú)血栓形成的影響

以5 dpf斑馬魚(yú)仔魚(yú)為模型，以三氯化鐵為血栓形成誘導(dǎo)劑，對(duì)20種中藥材單體成分進(jìn)行了抗血栓形成活性檢測(cè)，結(jié)果顯示其中7種中藥材具有抑制血栓形成活性。桃葉珊瑚苷10 μg/mL具有明顯的抑制斑馬魚(yú)血栓形成作用，40 μg/mL處理組的血流時(shí)間超過(guò)了2 h。在銀杏內(nèi)酯B 20 μg/mL和40 μg/mL處理組，三氯化鐵誘導(dǎo)后的血流時(shí)間分別為(51.7±8.3)min和(69.5±9.7)min。黃芪甲苷、芍藥苷、甘草次酸、銀杏內(nèi)酯A和葛根素也表現(xiàn)出了不同程度的血栓形成抑制作用(表1)。

表1 中藥材單體成分對(duì)斑馬魚(yú)血栓形成的抑制作用(x ± s，n=30)

3.2 中藥單體成分對(duì)血小板體外聚集的影響

以離體血小板為模型，對(duì)上述20種中藥材成分進(jìn)行了血小板聚集實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示12種中藥材成分具有抑制血小板聚集的作用，其中100 μg/mL 紅景天苷的血小板聚集抑制率為88.22%，100 μg/mL苦參堿抑制率為64.54%，25 μg/mL銀杏內(nèi)酯B抑制率為30.70%，50 μg/mL黃芪甲苷抑制率為53.91%，25 μg/mL 桃葉珊瑚苷抑制率39.71%，100 μg/mL 金絲桃苷抑制率為88.68%，50 μg/mL 芍藥苷抑制率為26.77%，50 μg/mL 大豆苷元抑制率為27.14%，50 μg/mL甘草次酸抑制率為59.57%，50 μg/mL 大豆苷抑制率為30.83%，50 μg/mL銀杏內(nèi)酯A抑制率為30.23%，25 μg/mL 葛根素抑制率為64.31%(表2)。

表2 中藥材單體成分對(duì)血小板聚集的影響(n=10)

基于斑馬魚(yú)模型抗血栓實(shí)驗(yàn)和體外抗血小板聚集的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)(表3)，姜黃素[12]沒(méi)有體外血小板抗凝作用。與本研究結(jié)果一致。綠原酸[13]、甘草苷[14]、莽草酸[15]和銀杏內(nèi)酯C[16]、甘草次酸[17]、銀杏內(nèi)酯A[18]、桃葉珊瑚苷[19]對(duì)體外血小板聚集有抑制作用；虎杖苷[20]、苦參堿[21]和葛根素[22]可以抑制血小板聚集和微血栓的形成；銀杏內(nèi)酯B[23]、金絲桃苷[24-25]和紅景天苷[26]已被證實(shí)具有體外抗血小板凝聚活性和體內(nèi)抗血栓作用；芍藥苷[27]、黃芪甲苷[28]、大豆苷元和大豆苷[29]等單體中藥成分，未見(jiàn)在其他動(dòng)物血栓模型上具有活性作用的單獨(dú)文獻(xiàn)報(bào)道，但都作為某些有效抗血栓藥物或抑制血小板聚集藥物成分一并報(bào)道過(guò)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致，但某些中藥單體成分抗血栓形成活性不一致，其可能原因是采取的中藥成分單體用量以及采用的實(shí)驗(yàn)方法不同所致。

表3 中藥材單體成分抗血栓形成活性對(duì)比表

續(xù)表3

4 結(jié)語(yǔ)

本研究利用斑馬魚(yú)血栓模型，對(duì)多種中藥活性單體成分同時(shí)進(jìn)行抗血栓活性檢測(cè)，較其他傳統(tǒng)動(dòng)物血栓模型用藥微量、高效，能夠高通量篩選抗栓活性成分。篩選出的活性成分通過(guò)血小板體外聚集實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及查閱文獻(xiàn)比對(duì)，說(shuō)明斑馬魚(yú)血栓模型對(duì)抗栓藥物的篩選有很好的適用性，這為發(fā)現(xiàn)抗血栓中藥活性單體提供了一個(gè)研究思路，為制造抗血栓藥物提供了可行的研究切入點(diǎn)。

下一步工作可以結(jié)合已報(bào)道的文獻(xiàn)，對(duì)篩選出的抗血栓中藥活性單體進(jìn)行作用機(jī)制探索。