袁敏，梁瑞雪，劉青

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

利濕通淋顆粒的組方是在經(jīng)典方五味消毒飲、滋腎通關(guān)丸及程氏萆薢消毒飲的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而來(lái)的治療濕熱瘀阻型慢性前列腺炎的有效方劑，具有消炎抗菌、清熱利濕、活血通絡(luò)的作用，該制劑組方由黃柏、蒲公英、石韋、益母草、苦地丁、金錢草、王不留行、皂角刺、川牛膝、綿萆薢等10味中藥組成，臨床使用多年，治療濕熱瘀阻型慢性前列腺炎及前列腺痛引起的各種癥狀療效顯著[1]。

本制劑所用黃柏為蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchineseSchneid.)的干燥樹皮，習(xí)稱“川黃柏”，具有清熱、消腫、止痛等作用[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃柏在抗菌消炎、降血糖、抗癌及治療免疫系統(tǒng)疾病等方面具有獨(dú)特的療效[3-4]，其所含主要化學(xué)成分為生物堿類和黃酮類成分，其中小檗堿、藥根堿等生物堿類成分含量最高[5]。益母草為唇形科植物益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)的干燥地上部分，具有活血調(diào)瘀、利尿消腫之功效[2]。益母草是一種常見(jiàn)的活血化瘀藥,《本草綱目》中稱之為“血家之圣藥”，除了有活血調(diào)經(jīng)的功效之外,還具有良好的活血化瘀、祛腐生新作用，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[6-7]。益母草全草含生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.11%～2.09% ,其中益母草堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～0.12%[8]。

在利濕通淋顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，曾對(duì)蒲公英中所含有機(jī)酸類成分綠原酸和咖啡酸、金錢草中所含黃酮類成分槲皮素、苦地丁中所含紫堇靈、石韋中所含的綠原酸、王不留行中所含王不留行黃酮苷、川牛膝中所含杯莧甾酮均進(jìn)行了HPLC含量測(cè)定[9-14]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在缺蒲公英或金錢草或石韋的陽(yáng)性樣品中綠原酸、咖啡酸、槲皮素的專屬性試驗(yàn)均有干擾，對(duì)苦地丁、王不留行和川牛膝的供試品溶液多次調(diào)整制備方法和HPLC色譜條件，也未能成功檢測(cè)到各藥材所含成分的色譜峰，本處方中的皂角刺和綿萆薢在2015年版《中國(guó)藥典》中沒(méi)有明確的含量測(cè)定方法。黃柏中所含有效成分小檗堿和益母草中所含有效成分益母草堿均為利濕通淋顆粒中的主要藥效成分，且小檗堿和益母草堿性質(zhì)穩(wěn)定，易于檢測(cè)。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，相同類成分干擾較多。對(duì)方中多味中藥進(jìn)行了含量測(cè)定預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，HPLC含量測(cè)定以黃柏中的小檗堿和益母草中的益母草堿作為檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，無(wú)其他成分干擾，且測(cè)定方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好，因此選擇制劑中小檗堿和益母草堿的含量作為利濕通淋顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與試劑

1.1 儀器

Waters e2695-2998高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；BT125D十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；SB5200DTS超聲波雙頻清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 試藥與試劑

鹽酸小檗堿(批號(hào)0713-9906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.14%，供含量測(cè)定用)，鹽酸益母草堿(批號(hào)111823-201704，純度94.30%，供含量測(cè)定用)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。利濕通淋顆粒及缺黃柏、缺益母草陰性樣品均是根據(jù)處方工藝自制。

磷酸(批號(hào)20181212，萊陽(yáng)市康德化工有限公司)；十二烷基硫酸鈉(批號(hào)20160801，天津市鼎盛鑫化工有限公司)；辛烷磺酸鈉(批號(hào)Q/12KM4285-2018 ,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、甲醇(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?為色譜純；水為超純水；所用其他試劑均為分析純。

2 含量測(cè)定

2.1 小檗堿含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相超聲、溶解，制成每1 mL含26.0 μg的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取供試品顆粒2.0 g，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置于100 mL量瓶?jī)?nèi)，精密加入流動(dòng)相80 mL,超聲處理40 min，放冷，用流動(dòng)相定容，搖勻，采用0.45 μm 的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 缺黃柏陰性溶液的制備

按照利濕通淋顆粒的處方比例，稱取除黃柏之外的其他中藥飲片，按照已經(jīng)確定好的該制劑提取工藝和成型工藝，制得不含黃柏的陰性樣品。按2.1.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制得缺黃柏的陰性溶液。

2.1.5 專屬性試驗(yàn)

對(duì)鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺黃柏陰性溶液分別精確吸取各10 μL，注入高效液相色譜儀(HPLC)，測(cè)定。結(jié)果在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置處，供試品溶液出現(xiàn)相應(yīng)的吸收峰，而缺黃柏陰性溶液未出現(xiàn)干擾峰。說(shuō)明該測(cè)定方法無(wú)干擾、專屬性好,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對(duì)照品、供試品、缺黃柏陰性溶液的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride, test sample, and phellodendron negative control solution

2.1.6 線性關(guān)系考察

取2.1.2項(xiàng)下質(zhì)量濃度為26 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2、5、10、15、20 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以鹽酸小檗堿的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得方程為Y=4 501 958X-2351，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 6。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在進(jìn)樣量為0.052～0.520 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn)

對(duì)2.1.2項(xiàng)下鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，每次精確吸取10 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得對(duì)照品的峰面積值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.604%(n=6)，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.1.3項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h精密進(jìn)樣10 μL，測(cè)定供試品溶液的峰面積值，經(jīng)計(jì)算，RSD為1.25%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取實(shí)驗(yàn)室自制的利濕通淋顆粒(批號(hào)20190528)，按照2.1.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行操作6份，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，經(jīng)計(jì)算，高效液相測(cè)定的小檗堿含量平均值為6.00 mg/g，RSD為1.00%(n=6)，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.1.10 回收率試驗(yàn)

取自制利濕通淋顆粒(批號(hào)20190528)6份，每份取約0.1 g，精密稱定，置于100 mL量瓶?jī)?nèi)，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.063 8 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液10 mL，按照2.1.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行操作6份，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。小檗堿的加樣回收率均值為99.43%，回收率在96.20%～102.10%，RSD為2.08%，表明本方法的回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 益母草堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸益母草堿對(duì)照品適量，加70%的乙醇制成質(zhì)量濃度為19.8 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取自制的利濕通淋顆粒20 g，研細(xì)，取約2.0 g，精確稱定質(zhì)量，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入精確量取的甲醇50 mL,稱定總質(zhì)量，超聲提取(250 W，40 kHz)40 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足質(zhì)量，振搖均勻，采用0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，收集續(xù)濾液即得。

2.2.4 缺益母草陰性溶液的制備

按照利濕通淋顆粒的處方比例，稱取除益母草之外的其他中藥飲片，按照已經(jīng)確定好的該制劑的提取工藝和成型工藝，制得不含益母草的陰性樣品。按2.2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法，制得缺益母草的陰性溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn)

對(duì)鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺益母草陰性溶液分別精確吸取各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置處，供試品溶液出現(xiàn)相應(yīng)的吸收峰，而缺益母草陰性溶液未出現(xiàn)干擾峰。說(shuō)明該測(cè)定方法無(wú)干擾、專屬性好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 鹽酸益母草堿對(duì)照品、供試品溶液、缺益母草陰性對(duì)照溶液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of leonurine hydrochloride, test solution, and leonurine negative control solution

2.2.6 線性關(guān)系考察

取2.2.2項(xiàng)下濃度為19.8 μg/mL的鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、5、10、15、20 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以鹽酸益母草堿對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得方程為Y=1 816 187X-9622，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，結(jié)果表明鹽酸益母草堿在進(jìn)樣量為0.039 6～0.396 0 μg的質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度考察

對(duì)2.2.2項(xiàng)下鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液，每次精確吸取10 μL，按照2.2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得對(duì)照品的峰面積值RSD為0.827%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h精密進(jìn)樣10 μL，測(cè)定供試品溶液的峰面積值，經(jīng)計(jì)算，RSD為1.62%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批自制利濕通淋顆粒(批號(hào)20190528)，按照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行操作6份，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，經(jīng)計(jì)算，高效液相測(cè)定的益母草堿含量的平均值為0.106 6 mg/g，RSD為1.712%(n=6)，表明該分析方法的重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗(yàn)

取自制利濕通淋顆粒(批號(hào)20190528)6份，每份取約1.0 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶?jī)?nèi)，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.051 3 mg/mL的鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液2 mL，按照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行操作6份，分別吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，經(jīng)計(jì)算，益母草堿的加樣回收率均值為101.2%，回收率在99.90%～102.6%，RSD為1.13%，表明本方法的回收率良好。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 3批樣品含量測(cè)定

取3個(gè)不同批號(hào)的利濕通淋顆粒(批號(hào)20190528、20190529、20190530)，按照2.1.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法，每批平行操作3份，制備3批供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相儀測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，該含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好。

表3 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 提取方法的選擇

在小檗堿的含量測(cè)定中，制備供試品溶液時(shí)，考察了提取溶劑甲醇、乙醇和流動(dòng)相，試驗(yàn)結(jié)果表明，流動(dòng)相提取的供試品溶液進(jìn)行HPLC含量測(cè)定時(shí)，雜質(zhì)干擾最少，提取的小檗堿含量最高，因此，選擇流動(dòng)相作為提取溶劑。在益母草堿的含量測(cè)定中，制備供試品溶液時(shí)，考察了提取溶劑甲醇、乙醇和70%的乙醇，試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇提取的供試品溶液進(jìn)行HPLC含量測(cè)定時(shí)，雜質(zhì)干擾最少，提取的益母草堿含量最高。因此，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 流動(dòng)相的選擇

在小檗堿的含量測(cè)定中，根據(jù)參考文獻(xiàn)[17-19]比較了多種流動(dòng)相系統(tǒng)，包括乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈-0.1%的甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基硫酸鈉0.1 g)，結(jié)果表明采用乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基硫酸鈉0.1 g)作為流動(dòng)相，圖譜的基線平穩(wěn)， 峰型好，各峰均沒(méi)有拖尾。益母草堿的含量測(cè)定中[10,20]，比較了甲醇-0.1%的甲酸水溶液、乙腈-0.01%的磷酸水溶液、乙腈-0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%的磷酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明采用乙腈-0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液，圖譜的基線平穩(wěn)，前后分離度較好[21-22]。

本試驗(yàn)所建立的利濕通淋顆粒的 HPLC 法同時(shí)測(cè)定小檗堿和益母草堿的含量，測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于利濕通淋顆粒的質(zhì)量控制與分析。