劉超，王志苗，胡和生，陳明友，穆偉，徐振興，閆素華，薛梅

山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）心血管病學(xué)山東省醫(yī)藥衛(wèi)生心律失常重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250000

心臟自主神經(jīng)病變（CAN）是糖尿?。―M）最常見的并發(fā)癥之一［1-4］。目前，糖尿病心臟自主神經(jīng)?。―CAN）的病因尚不明確，但神經(jīng)生長因子（NGF）水平降低已被證實(shí)參與了DCAN 的發(fā)生。IEDA等［5］研究顯示，心臟組織NGF 表達(dá)降低是DM 神經(jīng)病變的原因之一。前期研究顯示，DM 大鼠心臟組織NGF 蛋白表達(dá)降低不均勻與心臟交感神經(jīng)異質(zhì)性的發(fā)生有關(guān)，提示心臟組織NGF 蛋白表達(dá)可能參與了室性心律失常（VAs）的發(fā)生發(fā)展［6-7］。目前為止，關(guān)于治療DCAN 繼發(fā)VAs 的相關(guān)研究較少。有研究將外源性NGF 注入患有心肌梗死犬的右星狀神經(jīng)節(jié)，發(fā)現(xiàn)其QT 間期（QTc）縮短，且VAs 發(fā)生率降低［8］。2019 年1 月—2020 年3 月，本研究向DM 大鼠右星狀神經(jīng)節(jié)注入外源性NGF，觀察其對大鼠左、右心室交感神經(jīng)和VAs的影響，為DCAN 的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物：雄性Wistar 大鼠70 只，7 周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自山東大學(xué)動物中心；標(biāo)準(zhǔn)條件下大鼠單只放置于溫、濕度可控的房間里，自由攝食、攝水。主要試劑：鏈脲佐菌素（STZ）、3% 戊巴比妥鈉購自美國Sigma 公司，酪氨酸羥化酶（TH）一抗購自美國Millipore 公司，牛血清白蛋白購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Prime Script RT 試劑盒購自日本TaKaRa 公司。嚙齒動物呼吸機(jī)（HX-300S）購自成都泰盟科技有限公司。

1.2 DM 模型建立及分組處理 將70 只雄性Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對照組20 只、DM 組25 只和DN 組25 只。DM 組、DN 組通過向大鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg的方法建立DM模型［7］，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。DM 建模成功標(biāo)準(zhǔn)：腹腔注射STZ 后48 h 非空腹血糖＞250 mg/dL。持續(xù)喂養(yǎng)第20 周時，DM 組和DN 組大鼠腹腔注射3% 戊巴比妥鈉50 mg/kg 進(jìn)行麻醉；以C7棘突的軟骨突為大鼠右星狀神經(jīng)節(jié)標(biāo)志，DN組于此處注射外源性NGF 20 μg/kg，NGF 分3 次注射，每3 d 注射1次，DM 組于此處注射等量生理鹽水［9-10］。隨后再持續(xù)喂養(yǎng)4周，共喂養(yǎng)24周，期間每周記錄大鼠體質(zhì)量及空腹血糖，血糖過高者給予魚精蛋白胰島素腹腔注射，維持血糖在350～450 mg/dL，剔除過于瘦弱和血糖超過600 mg/dL 的大鼠，最終對照組14 只、DM組19只和DN組19只。

1.3 心臟電生理檢查

1.3.1 VAs 誘發(fā)情況 各組持續(xù)喂養(yǎng)24 周后進(jìn)行麻醉，用嚙齒動物呼吸機(jī)進(jìn)行氣管內(nèi)插管機(jī)械通氣輔助呼吸，開胸后將電極植入右心室心外膜表面，用該電極進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的刺激方案［11］。以120 ms 的周期長度（S1）進(jìn)行8 次節(jié)律性搏動以誘導(dǎo)VAs，然后以略短于120 ms 的間隔進(jìn)行1～3 個額外刺激（S2、S3、S4）；設(shè)置刺激強(qiáng)度為起搏閾值的2 倍，刺激時長為5 ms。使用生物信號采集系統(tǒng)（BL-420S）執(zhí)行并進(jìn)行記錄，實(shí)驗(yàn)方案在10 min內(nèi)完成，發(fā)生單形性室性心動過速、多形性室性心動過速、室撲和室顫均視為成功誘發(fā)VAs，記錄三組大鼠VAs誘發(fā)情況。

1.3.2 QTc、QT 離散度（QTd）測量 在1.3.1 行電生理檢查時測量并記錄三組大鼠的QTc、QTd。在QRS 波群開始到T 波回到等電線的3 個連續(xù)搏動中測量QTc，QTc=QT/RR，以最長QTc減去最短QTc的絕對值計算QTd?；€QTc 和QTd 均使用Bazett 公式進(jìn)行校正。

1.4 左、右心室TH 陽性神經(jīng)纖維分布及密度檢測 采用免疫組化法。各組大鼠電生理檢查完畢后，處死取出心臟，生理鹽水洗凈。取一部分左、右心室組織，10% 甲醛固定24 h，石蠟包埋，5 μm 厚度進(jìn)行切片。將石蠟切片去石蠟，重新水化，3%H2O2溶液中孵育，PBS 洗滌10 min 以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。92～98 ℃條件下，將玻片在0.1% 檸檬酸緩沖液中浸泡15 min，冷卻至室溫后用PBS 洗滌。牛血清白蛋白封閉，加入抗TH 一抗（稀釋比例1∶500），孵育2 h；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min；DAB顯色試劑盒檢測免疫反應(yīng)產(chǎn)物。將切片用蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察可見TH 陽性神經(jīng)纖維染色呈棕色，以TH 陽性神經(jīng)纖維染色情況表述左、右心室交感神經(jīng)的分布特征。 使用Image-Pro plus 6.0 軟件識別TH 陽性神經(jīng)纖維，TH陽性神經(jīng)纖維密度＝標(biāo)記的神經(jīng)纖維面積/視野總面積［12］。每只大鼠均選取左、右心室共6個切片，并選擇至少3個視野計算平均TH陽性神經(jīng)纖維密度。

1.5 左、右心室組織TH、NGF mRNA 表達(dá)檢測采用Real-time PCR 法。取各組新鮮的左、右心室組織，TRIzol 法提取總RNA，Prime Script RT 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過SYBR Premix Ex Taq 進(jìn)行實(shí)時PCR 檢測。引物序列：TH 上游引物5′-ACTGGAGGCTGTGGTATTTGAG-3′，下 游 引 物5′-GAGACAAGGAGGAGGAGGGTTTTG-3′；NGF 上 游 引 物5′-TCGCTCACTCCACTATCCACT-3′，下游引物5′-AGCTCAACAGGGCAAGCATAC-3′；內(nèi)參GAPDH 上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引 物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，重復(fù)后兩步循環(huán)40 次。采用2－ΔΔCt法［13］計算TH、NGF mRNA 相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗(yàn)和配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠VAs 發(fā)生率及QTc、QTd 比較 對照組、DM 組和DN 組VAs 發(fā)生率分別為7.1%（1/14）、42.1%（8/19）、10.5%（2/19），DM 組VAs 發(fā)生率及QTc、QTd 均高于對照組和DN 組（P均＜0.05）；對照組和DN 組VAs 發(fā)生率及QTc、QTd 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 三組大鼠QTc、QTd比較（ms，± s s）

表1 三組大鼠QTc、QTd比較（ms，± s s）

注：與對照組及DN組比較，*P＜0.05。

組別對照組DM組DN組n 14 19 19 QTc 91.23 ± 2.12 99.67 ± 1.79*92.17 ± 1.98 QTcd 32.13 ± 2.31 35.21 ± 2.40*33.16 ± 2.76

2.2 三組大鼠左、右心室TH 陽性神經(jīng)纖維分布及密度比較 DM 組右心室TH 陽性神經(jīng)纖維密度低于左心室（P＜0.05），對照組和DN 組的左、右心室TH 陽性神經(jīng)纖維密度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；在相同心室，DM 組TH 陽性神經(jīng)纖維密度均低于對照組和DN 組（P均＜0.05），對照組和DN 組TH 陽性神經(jīng)纖維密度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。TH 陽性神經(jīng)纖維分布情況：對照組TH 陽性神經(jīng)纖維主要分布在血管周圍，并表現(xiàn)為沿相鄰肌纖維蛋白的縱軸走行，左心室神經(jīng)纖維多粗于右心室（圖1A、B）；DM 組左、右心室TH 陽性神經(jīng)纖維分布特征與對照組相似，但密度及神經(jīng)纖維直徑低于對照組（圖1C、D）；DN 組左、右心室TH 陽性神經(jīng)纖維分布情況、密度及直徑均接近對照組（圖1E、F）。

圖1 三組TH陽性神經(jīng)纖維分布情況（免疫組化法）

表2 三組大鼠左、右心室TH陽性神經(jīng)纖維密度比較（± s s）

表2 三組大鼠左、右心室TH陽性神經(jīng)纖維密度比較（± s s）

注：與同組左心室比較，*P＜0.05；與對照組及DN 組相同心室比較，#P＜0.05。

組別對照組DM組DN組n 14 19 19左心室2 412.0 ± 119.8 1 658.0 ± 129.8#1 889.0 ± 110.9右心室2 298.0 ± 112.0 1 012.0 ± 154.2*#1 780.0 ± 98.6

2.3 三組大鼠左、右心室TH、NGF mRNA 表達(dá)比較 DM 組右心室TH、NGF mRNA 相對表達(dá)量均低于左心室（P均＜0.05），對照組和DN組的左、右心室比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；在相同心室，DM組TH、NGF mRNA相對表達(dá)量均低于對照組和DN 組（P均＜0.05），對 照 組 和DN 組TH、NGF mRNA 相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 三組大鼠左、右心室TH、NGF mRNA表達(dá)比較（x ± s）

3 討論

交感神經(jīng)系統(tǒng)在心臟的正常生理功能中起關(guān)鍵作用［12-15］。前期研究發(fā)現(xiàn)，DM 可導(dǎo)致心臟中NGF表達(dá)的不均勻下降，導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域內(nèi)交感神經(jīng)分布不對稱，從而發(fā)生DCAN，進(jìn)一步引起VAs 發(fā)生率升高［6］。在具有DCAN 的DM 患者中，交感神經(jīng)的不均勻分布可引起心肌的不對稱電重構(gòu)，從而增加了心臟電生理的異質(zhì)性和分散性，以上均可導(dǎo)致QTc 延長和VAs 發(fā)生率升高［16-18］。本研究結(jié)果顯示，DM 組VAs 發(fā)生率及QTc、QTd 均高于對照組，說明DM 可促進(jìn)大鼠QTc、QTd升高及VAs的發(fā)生，與WHITSEL等［19］研究結(jié)果一致。

兒茶酚胺是人體內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，由酪氨酸經(jīng)過一系列反應(yīng)合成而來；TH 是此過程第一個催化酶，也是限速酶，其檢測為陽性的部位可代表交感神經(jīng)的分布。本研究結(jié)果顯示，DM 組大鼠左、右心室TH 陽性神經(jīng)纖維密度和TH mRNA表達(dá)均顯著低于對照組，且DM 組左心室中TH 陽性神經(jīng)纖維密度和TH mRNA 表達(dá)高于右心室；提示DM 大鼠存在明顯的左、右心室交感神經(jīng)異質(zhì)性，結(jié)合DM 組VAs 發(fā)生率較對照組顯著增加，QTc、QTd 較對照組顯著延長，推測可能是右心室明顯的去神經(jīng)化導(dǎo)致DM 大鼠左心室交感神經(jīng)相對亢進(jìn)。為了減少DM 大鼠左、右心室之間的交感神經(jīng)分布和電生理的異質(zhì)性，本研究將NGF 注入右星狀神經(jīng)節(jié)。結(jié)果顯示，DN 組左、右心室TH 和NGF mRNA 表達(dá)無顯著差異，說明其左、右心室交感神經(jīng)異質(zhì)性和NGF 的分布異質(zhì)性均消失；在相同心室中，DN 組VAs 發(fā)生率、QTc、QTd 均明顯低于DM 組，TH 陽性神經(jīng)纖維密度和TH mRNA 表達(dá)均明顯高于DM 組，并與對照組比較無明顯差異；表明NGF 注入右星狀神經(jīng)節(jié)后，DM 大鼠左心室和右心室之間交感神經(jīng)支配的異質(zhì)性得到緩解，QTc、QTd 降低，從而減少了VAs 的發(fā)生。

分析右星狀神經(jīng)節(jié)注入外源性NGF 減少DM 大鼠VAs 發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，一是可能與來自右星狀神經(jīng)節(jié)的傳入交感神經(jīng)纖維導(dǎo)致左星狀神經(jīng)節(jié)中交感神經(jīng)被抑制有關(guān)［20］；其次可能與NGF 注入右星狀神經(jīng)節(jié)導(dǎo)致右心室交感神經(jīng)過度亢進(jìn)，從而降低左、右心室之間的電生理異質(zhì)性有關(guān)［8］。在DM 大鼠中，外源性NGF 可能會增加軸突和神經(jīng)元的再生，改善神經(jīng)內(nèi)膜血流量，并刺激神經(jīng)生長，這些均可能導(dǎo)致心室尤其是右心室的區(qū)域性交感神經(jīng)再生。隨著心室左右電生理異質(zhì)性的修復(fù)，QTc逐漸降低，心臟對電刺激的反應(yīng)性也降低。因此，DM大鼠的VAs發(fā)生率也顯著降低，但是其具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DM 大鼠存在左、右心室交感神經(jīng)去神經(jīng)化的不均衡性及交感神經(jīng)分布的異質(zhì)性，使該區(qū)域出現(xiàn)電生理的不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為QTc、QTd 明顯延長和VAs 發(fā)生率增加；右星狀神經(jīng)節(jié)注入外源性NGF 可通過降低左、右心室交感神經(jīng)異質(zhì)性及縮短QTc、QTd而減少DM大鼠VAs的發(fā)生。