殷玉，王亞紅，許志亮，劉剛

1 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，524000；2 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心

大多數(shù)支氣管肺癌患者是非小細胞肺癌（NSCLC），患者被診斷為NSCLC 時通常為疾病晚期，腫瘤細胞已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)及其他器官的轉(zhuǎn)移，患者5 年生存率僅為14%［1-2］。研究顯示，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者5 年生存率可達83%［3］。因此，腫瘤細胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對于NSCLC 患者的預(yù)后至關(guān)重要。肺癌生物標志物的鑒定有助于NSCLC 的早期診斷、治療以及預(yù)后判斷。越來越多的研究證明，微小RNA（miRNA）參與調(diào)控細胞分化、增殖和存活的各種信號通路，在多種類型的腫瘤細胞中表達異常。研究發(fā)現(xiàn)，miR-363-3p 參與調(diào)控膽囊癌［4］、胃癌［5-6］和膠質(zhì)瘤［7］等多種腫瘤細胞的遷移與侵襲。但目前關(guān)于miR-363-3p 在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織及細胞中的表達變化，以及是否對高轉(zhuǎn)移性的NSCLC 細胞遷移與侵襲有直接調(diào)控作用尚不明了［8-9］。為此，我們于2020 年1 月—2021 年6 月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人NSCLC 細胞株A549 及高轉(zhuǎn)移性NSCLC 細胞株H441 均購自美國ATCC。主要試劑：TRIzol 試劑、細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，miRcute miRNA First-Strand cDNA Syntnesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR 試劑均購自北京天根生物科技有限公司，蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，GAPDH 抗體購自上海生工生物工程科技有限公司，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，細胞遷移測試盒購自美國BD 公 司。miR-363-3p mimics 和miR-363-3p inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.2 發(fā)生和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 組織miR-363-3p 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。選取2013年1月—2014年3月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院保存的、發(fā)生和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 組織樣本各26、21 例份。加入組織裂解液，使用TRIzol 試劑提取總RNA，并使用miRcute miRNA First-Strand cDNA Syntnesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，進行PCR反應(yīng)。miR-363-3p引物序列：上 游 引 物5′-TGGGGTGAGAGGTGATAGAGG-3′，下 游 引 物5′-CGGCGTCTGCTGAACAAATAC-3′；U6 引物序列：上游引物5′-CTCGGTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 PCR 反應(yīng)體系10 μL：1×SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ5.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，滅菌蒸餾水（dH2O）3.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計算miR-363-3p 相對表達量。

1.3 A549、H441 細胞miR-363-3p 表達檢測 將A549、H441 置于含10% 胎牛血清的低糖DMEM 中，37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并使用miRcute miRNA First-Strand cDNA Syntnesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以U6為內(nèi)參，參照1.2 采用實時熒光定量PCR 法檢測miR-363-3p相對表達量。

1.4 H441 細胞分組處理 將對數(shù)生長期的H441細胞接種于培養(yǎng)皿中，待細胞生長密度達70% 時分為三組，即對照組、miR-363-3p mimics 組、miR-363-3p inhibitor 組，分別使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染對照miRNA、miR-363-3p mimics、miR-363-3p inhibitor。轉(zhuǎn)染6 h，細胞換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 H441 細胞遷移或侵襲能力觀察 采用Transwell 法。取三組細胞，以2×104接種于聚碳酸酯Transwell 小室中（侵襲實驗需使用基質(zhì)膠預(yù)處理Transwell 小室），在下室添加含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。用棉簽從上孔中擦除非侵入細胞，70%乙醇固定侵入細胞30 min，0.2% 結(jié)晶紫染色10～30 min。隨機選擇5個視野，在倒置光學(xué)顯微鏡下對穿過小室的細胞進行計數(shù)，取平均值，計算遷移或侵襲細胞數(shù)。

1.6 H441 細胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-3 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集各組細胞，PBS 沖洗后，加入裂解液冰上裂解30 min，超聲破碎細胞，低溫離心后收集上清蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制及電泳；PVDF 轉(zhuǎn)膜，室溫條件下脫脂牛奶封 閉1 h，洗 滌2 次。 加 入E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-3 及內(nèi)參GAPDH 一抗（稀釋比例為1∶1 000），4 ℃搖床過夜孵育；洗膜后加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h。洗滌3 次，拍照顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)生和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 組織miR-363-3p 表達比較 發(fā)生和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 組織miR-363-3p 相對表達量分別為1.091 ±0.153、0.128 ± 0.336，二者比較P＜0.01。

2.2 A549、H441 細 胞miR-363-3p 表 達 比 較A549、H441 細 胞miR-363-3p 相 對 表 達 量 分 別 為1.02 ± 0.039、31.45 ± 1.158，二者比較P＜0.01。

2.3 三組細胞遷移和侵襲能力比較 miR-363-3p inhibitor 組、對照組、miR-363-3p mimics 組遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)均依次升高，兩組間比較P均＜0.05。見表1。

表1 三組遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)比較（個，± s s）

表1 三組遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)比較（個，± s s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-363-3p mimics 組比較，#P＜0.05。

組別對照組miR-363-3p mimics組miR-363-3p inhibitor組遷移細胞數(shù)227.67 ± 5.50 448.00 ± 7.00*155.66 ± 5.86*#侵襲細胞數(shù)225.33 ± 3.05 627.67 ± 3.21*192.00 ± 3.00*#

2.4 三組細胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-3蛋白表達比較 miR-363-3p inhibitor 組、對照組、miR-363-3p mimics組Vimentin、MMP-9、MMP-3蛋白相對表達量均依次升高、E-cadherin蛋白相對表達量依次降低，兩組間比較P均＜0.05。見表2、圖1。

表2 三組細胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-3蛋白相對表達量比較（± s s）

表2 三組細胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-3蛋白相對表達量比較（± s s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-363-3p mimics組比較，#P＜0.05。

組別對照組miR-363-3p mimics組miR-363-3p inhibitor組E-cadherin 1.00 ± 0.06 0.33 ± 0.08*1.34 ± 0.05*#Vimentin 1.00 ± 0.07 4.01 ± 0.04*0.93 ± 0.03*#MMP-9 1.00 ± 0.03 3.45 ± 0.04*0.84 ± 0.07*#MMP-3 1.00 ± 0.05 1.51 ± 0.06*0.85 ± 0.03*#

圖1 三組細胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-3蛋白表達條帶圖（Western blotting法）

3 討論

腫瘤細胞遷移和侵襲能力升高是腫瘤轉(zhuǎn)移及病情惡化的重要機制之一。研究表明，miR-363-3p 在胃癌中與LINC00858 存在相互作用，并靶向叉頭盒P4 蛋白（FOXP4），進而調(diào)控細胞增殖、遷移和侵襲［5］。同樣的，miR-363-3p 可靶向FEZF1-AS1 基因，通過FEZF1-AS1/miR-363-3p/HMGA2 軸在胃癌進展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［6］。在腎細胞癌中，lncRNA SNHG5 與miR-363-3p-Twist1 的直接相互作用可調(diào)控細胞侵襲和凋亡過程［11］。在膠質(zhì)瘤中，miR-363-3p通過靶向丙酮酸脫氫酶B（PDHB）的表達，參與調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡和侵襲，最終介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移［7］。另外，miR-363-3p 可通過介導(dǎo)SNAI2/CDH1 軸在體外促進胃腸道間質(zhì)瘤細胞的轉(zhuǎn)移［12］。以上研究提示，miR-363-3p 在不同腫瘤的轉(zhuǎn)移中均具有重要作用。然而，miR-363-3p 在NSCLC 細胞轉(zhuǎn)移中的作用還尚未明確。

本課題組早期研究結(jié)果顯示，miR-363-3p 表達水平與NSCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)關(guān)系［9］。此外，本課題組還證實了miR-363-3p 通過靶向PCNA 調(diào)控NSCLC 增殖［8-10］。以上說明，miR-363-3p 表達可能與肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān)。 本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 組織miR-363-3p 相對表達量明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 組織，高轉(zhuǎn)移性H441 細胞中的miR-363-3p 相對表達量明顯高于A549 細胞；提示miR-363-3p 可能參與了NSCLC 細胞的遷移與侵襲，但其是否直接參與調(diào)控NSCLC 的轉(zhuǎn)移還有待進一步證實。

E-cadherin 主要介導(dǎo)細胞間的黏附，其表達下降會使細胞間黏附能力降低，更加有利于腫瘤細胞向細胞基質(zhì)外擴散。Vimentin 與癌細胞的強侵襲性和易轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)，Vimentin 表達升高提示細胞遷移能力增強［13］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對細胞外基質(zhì)重塑、傷口愈合和血管生成至關(guān)重要，MMPs是基質(zhì)相關(guān)蛋白，可通過直接切割或從細胞外基質(zhì)結(jié)合體中釋放［14］。MMP-3 通過激活Ⅱ型肺泡上皮細胞中的Wnt/β-catenin 信號通路，增加裂解肺上皮細胞中的E-cadherin 活性，從而誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［14］。以MMPs 為代表的降解細胞外基質(zhì)蛋白酶廣泛參與到腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中，MMP-9 在ECM重塑和膜蛋白切割中起重要作用［15］。研究顯示，MMP-9 在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中均發(fā)揮作用［16-17］。同時，MMP-9 是NSCLC診斷的潛在生物標志物［18］。目前大量研究表明，MMP-9、MMP-3 與腫瘤細胞的侵襲性有關(guān)［18-20］。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-363-3p 可促進H441 細胞的遷移和侵襲，同時能夠顯著抑制E-cadherin 表達和促進Vimentin、MMP-3、MMP-9表達。

綜上所述，miR-363-3p 可能通過升高Vimentin、MMP-9、MMP-3 蛋白表達及降低E-cadherin 蛋白表達而促進NSCLC 細胞的遷移和侵襲。本研究為肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)病機制和靶向治療提供了科學(xué)依據(jù)，但是miR-363-3p 在調(diào)控NSCLC 細胞遷移與侵襲進程中的靶向基因及具體的分子機制還需進一步研究證實。