湯葆莎，吳 俐，翁敏劼，賴譜富，李怡彬

[1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003]

0 引言

【研究意義】麥角硫因（L-Ergothioneine,EGT）是自然界存在的一種小分子含硫化合物，也是一種結(jié)構(gòu)及功能獨(dú)特的天然稀有手性氨基酸。該化合物最初在麥角菌（Claviceps purpurea）中被發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞生理保護(hù)劑在人體內(nèi)對細(xì)胞有高度保護(hù)作用，有清除自由基、解毒、維持DNA 生物合成和細(xì)胞正常生長等多種生理功能[1-3]，在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。利用食用菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)麥角硫因，具有生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、產(chǎn)品安全等優(yōu)點(diǎn)，是生物合成麥角硫因的發(fā)展方向。【前人研究進(jìn)展】食用菌中含有EGT 且可用不同制備方法獲取已被學(xué)者證實(shí)。BAO H N D 等[4]從金針菇（Flammulina velutipes）子實(shí)體中提取到EGT，NANCY J D[5]從固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）菌絲體中提取到EGT，TEPWONG P 等[6]從液體發(fā)酵培養(yǎng)的香菇（Lentinus edodes）菌絲體中提取到EGT。STAMPFLI A R 等[7]、劉琦等[8]和VALACHOVá K 等[9]通過對EGT 不同制備方法比較后指出，生物發(fā)酵合成是低成本、規(guī)?；a(chǎn)EGT的主要模式，利用食用菌菌絲體液體發(fā)酵制備EGT是種較好的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方式，但仍有必要進(jìn)一步研究如何提高食用菌菌絲體深層發(fā)酵液中的EGT 含量。為此，眾多學(xué)者嘗試通過對食用菌深層發(fā)酵過程中的營養(yǎng)代謝調(diào)控研究來提高其發(fā)酵物EGT 產(chǎn)率。TEPWONG P等[10]研究了香菇菌絲體深層發(fā)酵液中添加不同碳源對菌絲體EGT 含量的影響，結(jié)果表明果糖可顯著提高其菌絲體中的EGT 含量；LEE W Y等[11]研究了紫黑靈芝（Ganoderma neo-japonicum）菌絲體深層發(fā)酵液中添加不同氨基酸對菌絲體EGT 含量的影響，結(jié)果表明蛋氨酸（Met）或半胱氨酸（Cys）可顯著提高其菌絲體EGT 含量。研究證實(shí)，人們可以通過調(diào)控食用菌菌絲體深層發(fā)酵液中的碳氮源、氨基酸種類來影響微生物發(fā)酵過程中的EGT 含量。杏鮑菇（Pleurotus eryngii）是集食用、藥用于一體的食用菌，研究證實(shí)通過深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體，其營養(yǎng)價(jià)值與室內(nèi)菌袋層架栽培的子實(shí)體相當(dāng)[12-13]，但其中的EGT 含量仍處在較低水平[10]。為有效提高杏鮑菇深層發(fā)酵液中的EGT含量，有必要通過碳氮源、氨基酸等營養(yǎng)控制手段來調(diào)控微生物發(fā)酵過程以提高EGT 產(chǎn)量。近年來，LIN S D 等[14]在研究杏鮑菇菌絲體深層發(fā)酵液的品質(zhì)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇菌絲體及發(fā)酵液中均含有一定量的EGT，進(jìn)而提出需進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物全利用以提高杏鮑菇深層發(fā)酵EGT 產(chǎn)率。【本研究切入點(diǎn)】但基于提高杏鮑菇深層發(fā)酵液中EGT 產(chǎn)率的培養(yǎng)配方鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，本文以提高杏鮑菇528 深層發(fā)酵物中EGT 含量為指標(biāo)，研究不同碳氮源對杏鮑菇528 固體培養(yǎng)平皿菌絲生長的影響，探討玉米糝粉和蛋白胨對杏鮑菇528 深層發(fā)酵菌絲生長的影響，再比較分析不同氨基酸對杏鮑菇528 液體培養(yǎng)發(fā)酵物麥角硫因含量的影響，最后依據(jù)EGT 含量來設(shè)計(jì)提高杏鮑菇528 發(fā)酵物麥角硫因含量的深層發(fā)酵營養(yǎng)配方，以解決目前杏鮑菇深層發(fā)酵菌絲體EGT 含量偏低的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇528 菌種為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。試驗(yàn)所需的碳氮源、氨基酸以及其他試劑均購于試劑公司，化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 發(fā)酵物干重檢測 采用真空冷凍干燥法，設(shè)置干燥流程為：-20 ℃ 1 h、-5 ℃ 2 h、20 ℃ 2 h、60 ℃至樣品完成干燥。具體操作方法為：將試驗(yàn)結(jié)束后的樣品-發(fā)酵物倒于可供冷凍干燥的器皿中，置于-40 ℃冰箱中預(yù)冷5～10 h 后，于真空冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-30ND，寧波新芝生物科技股份有限公司）中冷凍干燥24 h，取出已干燥的發(fā)酵物置于干燥皿中，使用電子天平稱量并記錄后，分裝于樣品袋內(nèi)。

1.2.2 麥角硫因含量檢測 參考姜文俠[15]的方法進(jìn)行檢測，檢測儀器為Waters e2695 型高效液相色譜儀。

色譜分析條件：Sunfire C18 150×4.6 mm 3.5 μm液相色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-水（3∶97）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：配制不同濃度（0.1 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、15.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1）的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液進(jìn)樣檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液配制：稱取粉碎后的凍干杏鮑菇528 發(fā)酵物樣品0.5 g，加入甲醇10 mL，攪拌均勻后用數(shù)控超聲波清洗器（KQ-600DV，昆山市超聲儀器有限公司）超聲處理20 min，中性濾紙過濾后用針筒吸取上清液1 mL，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。上機(jī)檢測麥角硫因含量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 杏鮑菇528 菌絲生長碳氮源的篩選 為了解杏鮑菇528 菌絲生長習(xí)性，試驗(yàn)以固體平皿培養(yǎng)的方式來進(jìn)行菌絲生長的適宜碳氮源篩選。固體平皿培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%（PDA 培養(yǎng)基），選?。浩咸烟恰Ⅺ溠刻?、蔗糖、乳糖和玉米糝粉作為待篩選碳源，玉米漿、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為待篩選氮源，培養(yǎng)基中各篩選碳氮源的比例皆為2%。培養(yǎng)基配制好后，于121 ℃高壓滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，將培養(yǎng)基倒入90 mm 平皿中，每個(gè)處理設(shè)計(jì)3 次重復(fù)。培養(yǎng)基冷卻凝固后接入直徑4～5 mm 的杏鮑菇528 菌塊，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)遮光培養(yǎng)9 d。菌絲萌發(fā)2 d 后，開始觀察菌絲生長情況，采用十字交叉法，每天測量菌落直徑，以菌絲長滿平皿的時(shí)間和菌絲形態(tài)來綜合判斷杏鮑菇528 固體培養(yǎng)菌絲生長的適宜碳氮源。

1.3.2 杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)碳氮源比例的篩選根據(jù)1.3.1 確定的最佳碳氮源，來設(shè)計(jì)杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)配方，碳氮源的比例均定為1.0%、2.0%、3.0%，配方其他成分為：麥麩細(xì)粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1%和維生素B60.1%，每處理設(shè)置3 次重復(fù)。配制后培養(yǎng)液于燒杯中觀察沉淀物情況，沉淀物情況以“+”表示（“+”越多表示沉淀物情況越嚴(yán)重），再檢測初始pH 值；將培養(yǎng)液分裝于250 mL 三角瓶中（100 mL/瓶，加玻璃珠5 粒/瓶），121 ℃滅菌20 min 后待培養(yǎng)基冷卻至常溫，每個(gè)三角瓶接入5 片直徑為8 mm 的杏鮑菇528 菌塊，置于25 ℃、180 rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)7 d 停止試驗(yàn)，取出氣生菌絲和玻璃珠，按1.2.1方法檢測其發(fā)酵物干重。最終根據(jù)發(fā)酵物干重、沉淀物情況和初始pH 值，來篩選適宜杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)的初始配方。

1.3.3 不同氨基酸對杏鮑菇528 液體培養(yǎng)發(fā)酵物麥角硫因含量的影響 在1.3.2 確定的深層發(fā)酵培養(yǎng)初始配方中分別添加0.15%濃度的待篩選氨基酸：天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸，每個(gè)處理3 次重復(fù)。將培養(yǎng)液分裝于250 mL 三角瓶中（100 mL/瓶，加玻璃珠5 粒/瓶），121 ℃滅菌20 min后待培養(yǎng)基冷卻至常溫，每瓶接入10 mL 的杏鮑菇528 液體母種，置于25 ℃、180 rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)7 d 停止試驗(yàn)，取出氣生菌絲和玻璃珠，將發(fā)酵物按1.2.1 方法真空冷凍干燥，凍干后按1.2.2方法檢測每個(gè)處理重復(fù)的混合樣本中的麥角硫因含量，根據(jù)發(fā)酵物干重和檢測出的麥角硫因含量來篩選有助于提高杏鮑菇發(fā)酵物麥角硫因含量的氨基酸。

1.3.4 提高杏鮑菇528 發(fā)酵物麥角硫因含量發(fā)酵配方的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)固體培養(yǎng)的碳氮源及液體培養(yǎng)的氨基酸篩選試驗(yàn)結(jié)果，提高杏鮑菇528 發(fā)酵物麥角硫因含量的發(fā)酵配方設(shè)計(jì)采用三因素三水平的正交試驗(yàn)，以麥角硫因含量作為考察指標(biāo)，按照L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素水平如表1 所示。250 mL 三角瓶裝液量為100 mL，加玻璃珠5 粒/瓶，121 ℃滅菌20 min 后待培養(yǎng)基冷卻至常溫。每瓶接入杏鮑菇528 液體母種10 mL，置于25 ℃、180 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)7 d 停止試驗(yàn)，取出氣生菌絲和玻璃珠，按1.2.1 方法將發(fā)酵物真空冷凍干燥，凍干后將每個(gè)處理重復(fù)樣本混勻并按1.2.2 方法檢測其麥角硫因含量。采用正交設(shè)計(jì)助手LATIN 3.1 對L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以確定提高杏鮑菇發(fā)酵物麥角硫因含量的發(fā)酵配方。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮源培養(yǎng)基對杏鮑菇528 菌絲生長的影響

從圖1 菌絲生長態(tài)勢和圖2-A 菌絲生長速率變化可以看出，杏鮑菇528 菌絲在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和玉米糝粉這5 種碳源制作的PDA 平板培養(yǎng)基都可以生長，但菌絲生長情況存在差異，這表明杏鮑菇528 菌種對碳源的利用有選擇性。試驗(yàn)結(jié)果表明，在25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)遮光培養(yǎng)且其他培養(yǎng)條件不變時(shí)，玉米糝粉培養(yǎng)基中杏鮑菇菌絲生長態(tài)勢最強(qiáng)，生長速率最快，菌絲整齊均勻、潔白濃密，到第9 d 菌絲基本達(dá)滿皿水平；蔗糖培養(yǎng)基次之，菌絲長滿平皿的80%（7.2 cm）；麥芽糖和葡萄糖培養(yǎng)基的菌絲也較潔白濃密，菌絲達(dá)滿皿的70%～80%；乳糖培養(yǎng)基的菌絲雖濃白，但生長態(tài)勢最弱，生長速度最慢，到第9 d 菌絲才達(dá)其他處理組一半的水平。因此，其他培養(yǎng)條件不變時(shí)，適宜杏鮑菇528 菌絲生長的碳源為玉米糝粉。

圖1 不同碳、氮源培養(yǎng)基對杏鮑菇528 菌絲生長的影響（第9 d，左為碳源，右為氮源）Fig.1 Effects of different carbon and nitrogen source culture media on mycelial growth of Pleurotus eryngii 528 (At 9th day,left as carbon sources,right as nitrogen sources)

圖2 不同碳、氮源培養(yǎng)基杏鮑菇528 菌絲生長速率變化（A 為碳源，B 為氮源）Fig.2 Variation of mycelial growth rate of Pleurotus eryngii 528 with different carbon and nitrogen sources (A is carbon sources,B is nitrogen sources)

由圖1 和圖2-B 可知，杏鮑菇528 菌絲在添加不同添加氮源的PDA 平板培養(yǎng)基上也均能生長，但長勢存在差異，按菌絲總體生長態(tài)勢由好到差排序?yàn)椋旱鞍纂耍九Ｈ飧?≈ 酵母粉＞玉米漿。蛋白胨培養(yǎng)基上的杏鮑菇菌絲生長最快，且旺盛、整齊均勻，到第9 d 菌絲接近滿皿水平；牛肉膏和酵母粉培養(yǎng)基次之，菌絲達(dá)滿皿的70%～80%；而玉米漿培養(yǎng)基的菌絲也可生長，且濃白，但生長最慢，長勢才達(dá)其他處理組一半左右的水平，明顯不如其他氮源的培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白胨為杏鮑菇528 菌絲生長的適宜氮源。此研究結(jié)果與晏愛芬等[16]和馬璐[17]研究的杏鮑菇菌絲適宜碳氮源結(jié)果存在差異，這可能是杏鮑菇菌株不同導(dǎo)致其營養(yǎng)條件需求不一樣。

2.2 玉米糝粉和蛋白胨的比例對杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)的影響

在其他培養(yǎng)基成分不變的條件下，不同比例玉米糝粉和蛋白胨對杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵物干重的影響結(jié)果見表2。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玉米糝粉比例的加大，會(huì)使培養(yǎng)基沉淀物增多，這可能是由于玉米糝粉在蒸煮過程中淀粉糊化，釋放于培養(yǎng)液中，導(dǎo)致培養(yǎng)液中存在或多或少的沉淀物，這些淀粉沉淀的溶出增加了培養(yǎng)液的碳源濃度。當(dāng)玉米糝粉比例為2%時(shí)，發(fā)酵物干重顯著高于1%比例（P＜0.05），但與3%比例沒有明顯變化。從表2 可知，蛋白胨可在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的初始pH 值，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿俊?.0%濃度時(shí)，培養(yǎng)液初始pH 值＜5.00，這不利于杏鮑菇528深層發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵物干重顯著低于其他添加量處理組。不同玉米糝粉和蛋白胨濃度對杏鮑菇528液體深層發(fā)酵的菌絲生長有顯著影響，在其它培養(yǎng)條件不變下，2.0%玉米糝粉和2.0%蛋白胨培養(yǎng)液制備的杏鮑菇發(fā)酵物干重最多，達(dá)33.30±0.81 g·L-1，顯著高于其他碳氮源配比組合。因此，杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)適宜配方確定為：玉米糝粉2.0%、蛋白胨2.0%、麥麩細(xì)粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1%和維生素B60.1%。

表2 不同比例玉米糝粉和蛋白胨對杏鮑菇528 深層發(fā)酵培養(yǎng)液的沉淀物情況、初始pH 及發(fā)酵物干重影響Table 2 Effects of different proportions of corn grits and peptone on the sediment condition,initial pH in culture medium and dry weight of fermentation products of Pleurotus eryngii 528 submerged fermentation

2.3 氨基酸對杏鮑菇528 液體培養(yǎng)發(fā)酵物麥角硫因的影響

在2.2 確定的杏鮑菇528 深層發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸，考察這5 種氨基酸對杏鮑菇528 液體培養(yǎng)菌絲體合成麥角硫因的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氨基酸對發(fā)酵物麥角硫因含量的影響Fig.3 Effects of different amino acids on the content of ergothioneine in fermentation product

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源氨基酸對杏鮑菇528 液體培養(yǎng)發(fā)酵物干重沒有顯著影響，但圖3 可知，天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸這5 種氨基酸均可不同程度提高杏鮑菇528 液體培養(yǎng)發(fā)酵物麥角硫因含量。其中，組氨酸的效果最明顯，其發(fā)酵物麥角硫因含量為10.86 mg·L-1，分別是對照組（CK）的3.73 倍、天冬氨酸組的2.96 倍、精氨酸組的2.47 倍、半胱胺酸組的2.18 倍和谷氨酸組的1.66倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，組氨酸的添加有效促進(jìn)了杏鮑菇528 菌絲體發(fā)酵過程中麥角硫因的合成積累，杏鮑菇528 菌絲體麥角硫因含量比對照組增加了2.73倍，推測組氨酸可能是杏鮑菇528 生物合成麥角硫因的前體，因此，選擇組氨酸為提高杏鮑菇528 液體培養(yǎng)發(fā)酵物麥角硫因含量的外源氨基酸。不同真菌生物合成麥角硫因的前體不一樣。MELVILLE D B[18]等采用同位素示蹤法證明了粗糙鏈孢霉合成麥角硫因的前體為組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸；梅保良[19]研究表明蛋氨酸和半胱氨酸可提高糙皮側(cè)耳CGMCC 6232 深層發(fā)酵菌絲體麥角硫因含量。本研究發(fā)現(xiàn)組氨酸可促進(jìn)杏鮑菇528 菌絲體生物合成麥角硫因，但具體生物合成途徑有待進(jìn)一步研究。

2.4 以麥角硫因?yàn)槟繕?biāo)產(chǎn)物的正交試驗(yàn)

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 正交試驗(yàn)對杏鮑菇528 發(fā)酵物麥角硫因含量的數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表3 和表4。由表3 極差分析可知，各因素的影響的主次順序?yàn)椋篊＞A＞B，即組氨酸＞玉米糝粉＞蛋白胨。方差分析結(jié)果顯示，只有組氨酸呈顯著水平（P＜0.05），其余各因素對發(fā)酵物麥角硫因含量的影響均不顯著。在9 個(gè)序列組合中，序列4 組合的麥角硫因含量最高，達(dá)19.48 mg·L-1。因此，確定提高杏鮑菇528 發(fā)酵物麥角硫因產(chǎn)率的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米糝粉2.0%、蛋白胨1.5%、組氨酸0.15%、麥麩細(xì)粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1% 和維生素B60.1%。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of L9(34)orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4.2 正交試驗(yàn)驗(yàn)證 對正交試驗(yàn)結(jié)果篩選的配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)6 次，檢測出的麥角硫因平均含量為20.50±1.80 mg·L-1，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)方案結(jié)果相符合，說明該配方能有效提高杏鮑菇發(fā)酵物中麥角硫因的含量。

3 討論與結(jié)論

適宜杏鮑菇528 菌絲生長的碳氮源分別為玉米糝粉和蛋白胨；組氨酸可有效促進(jìn)杏鮑菇528 菌絲體深層發(fā)酵過程中麥角硫因的合成積累，添加組氨酸組的菌絲體麥角硫因含量比對照組增加了2.73 倍，推測組氨酸可能是杏鮑菇528 生物合成麥角硫因的前體；杏鮑菇528 深層發(fā)酵生物合成麥角硫因的最佳培養(yǎng)基配方為：玉米糝粉2.0%、蛋白胨1.5%、組氨酸0.15%、麥麩細(xì)粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1%和維生素B60.1%，在此條件下，杏鮑菇發(fā)酵物麥角硫因含量達(dá)20.50±1.80 mg·L-1。

本文試驗(yàn)表明，通過碳氮源、氨基酸等營養(yǎng)控制手段來調(diào)控杏鮑菇528 深層發(fā)酵物中的EGT 含量是可行且有效的，該方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，適宜規(guī)模化生產(chǎn)，可為開發(fā)富含EGT 的功能食品研發(fā)提供安全原料，應(yīng)用前景大。

杏鮑菇528 深層發(fā)酵不僅與培養(yǎng)液營養(yǎng)因子密切相關(guān)，還與培養(yǎng)溫度、通氣量、攪拌速度等發(fā)酵條件密切相關(guān)[20-22]。本研究僅基于營養(yǎng)調(diào)控手段來研究提高杏鮑菇528 發(fā)酵物EGT 含量的方法，后續(xù)仍需優(yōu)化提高發(fā)酵物EGT 含量的杏鮑菇528 深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步探究EGT 生物合成途徑和機(jī)理。