陳 堅，鄭益平，陳 彬，鄭斯平，鄭偉文

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】發(fā)明抗生素類藥物治療疾病是人類在20 世紀(jì)取得的最重要成就之一。但是由于微生物的變異迅速，引入抗生素后不久它們就會出現(xiàn)抗性基因ARGs（Antibiotic resistance genes），使治療藥物失效。并且在任何一種新的抗菌藥物引入后，都可能產(chǎn)生新的抗性基因，從而造成對抗生素的耐藥性[1]。2017 年，Razavi 等[2]報道，ARGs 可以通過可移動遺傳原件（Genetic mobile elements）的機制在細(xì)菌中傳播，造成ARGs 在環(huán)境中擴散，從而對公共健康構(gòu)成威脅。由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖的實踐中，抗生素不僅具有防治水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的效能，還能起到促進養(yǎng)殖動物生長的作用，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用極為廣泛[3-4]。濫用抗生素導(dǎo)致抗生素抗性基因在水源環(huán)境中迅速傳播，不僅對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成直接危害，也對人類健康產(chǎn)生重要影響[5-7]。因此，監(jiān)測和鑒定抗生素抗性基因在水源環(huán)境中的動態(tài)成為重要的課題?！厩叭搜芯窟M展】在水源環(huán)境中廣泛存在的水生蕨類植物滿江紅（Azolla）俗稱紅萍、綠萍，因富含氮素和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，在亞洲農(nóng)村被用作綠肥和飼料已有數(shù)百年歷史[8-9]。這種細(xì)小的植物繁殖快，生物量高，歸因于其葉腔中棲息著一種固氮藍(lán)藻。該藍(lán)藻形態(tài)酷似念珠藻（Nostoc），一般稱為滿江紅念珠藻（Nostocazollae），是由多個細(xì)胞串聯(lián)成的絲狀體，含有營光合作用的營養(yǎng)細(xì)胞和專司固氮的異形胞。異形胞含有編碼固氮酶的nif基因,可將大氣氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的結(jié)合態(tài)氮，以NH4的形態(tài)滿足宿主生長對氮素的需求。宿主則以蔗糖為主的碳源作為回報[10-11]。但近30 年來，人們先后從滿江紅的葉腔發(fā)現(xiàn)并分離培養(yǎng)出其第三個共生伙伴——細(xì)菌。它們與固氮藍(lán)藻一起構(gòu)成了滿江紅葉腔內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)。研究者們報道以自然界的滿江紅作為研究滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的材料，采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，從4 個生物種的滿江紅中分離鑒定出9 個屬15 個種的內(nèi)生細(xì)菌[12-13]。進入21 世紀(jì)后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，美國Raensallae 大學(xué)的Lechno 等[14]用rDNA-PCR 等方法從卡洲滿江紅的葉腔中鑒定出根癌農(nóng)桿菌、根瘤菌等4 種細(xì)菌。鄭斯平等[15]用PCRDGGE 和電鏡技術(shù)對滿江紅的葉腔和孢子果內(nèi)的細(xì)菌進行了檢測和觀察,揭示了小葉滿江紅葉腔以變形菌門為主的多種可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)菌,把對滿江紅內(nèi)生菌的表型多樣性的研究推進了一步。隨后，鄭斯平等[16]將小葉滿江紅的內(nèi)生菌經(jīng)16S rDNA-PCR擴增后用T-RFLP 技術(shù)和PAT 軟件分析，通過比對確定這些內(nèi)生菌屬于10 科42 屬?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于滿江紅是一種在淡水環(huán)境中生長的古老植物，內(nèi)生有豐富的微生物群落。鑒定與檢測滿江紅內(nèi)生菌的抗生素相關(guān)基因，可以從一個側(cè)面了解ARGs在水環(huán)境中傳播的狀況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】常用于檢測環(huán)境中抗生素抗性基因ARGs 的技術(shù)是PCR和微陣列技術(shù)，但近年來宏基因組學(xué)（Metagenomics）是新發(fā)展的一種基因組學(xué)技術(shù)，它通過從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建基因組文庫，利用基因組學(xué)的方法研究環(huán)境中所包含的全部微生物的基因組信息，以探究微生物的群落結(jié)構(gòu)和基因功能。隨著新一代測序技術(shù)的完善，以及測序成本的逐年快速下降，基于宏基因組學(xué)的抗生素抗性基因ARGs 的鑒定逐漸成為主流技術(shù)[17-18]，本研究擬用3 種不同的培養(yǎng)基對小葉滿江紅內(nèi)生菌進行培養(yǎng)，利用宏基因組學(xué)技術(shù)對培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌進行群落結(jié)構(gòu)及抗生素抗性基因的分析和檢測，為進一步研究滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的存在狀態(tài)，以及利用內(nèi)生細(xì)菌中抗生素抗性基因的檢測，了解植物與生長環(huán)境的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 滿江紅植物材料來源與制備

供試材料為小葉滿江紅（Azolla microphyllaKaulfus），早先從國際水稻研究所（International Rice Research Institute）引進，原編號為IRRI 4018。試驗前在網(wǎng)室中于自然氣候條件下長期培養(yǎng)保存，培養(yǎng)所用基質(zhì)為水土培養(yǎng)基，由取自田間的自然土高壓滅菌后加自來水配制而成。試驗時為了排除外源細(xì)菌等微生物的干擾，參照白克智等[19]的莖尖培養(yǎng)法，略為修改進行材料預(yù)處理，具體如下：取100 g（鮮重）在自然條件下生長的萍體，用自來水清洗，去掉黏附的土壤等雜物，剪去根系。后選取健康的萍體再用無菌水清洗。撈取洗凈的健康萍體，置于滅菌的燒杯中，加入適量的0.1%升汞溶液,將萍體浸沒,用滅菌的鑷子連續(xù)攪拌3.5 min，使?jié)M江紅的葉、莖和幼根充分與溶液接觸，以確保滅菌效果。隨后傾盡升汞溶液，迅速用無菌水清洗經(jīng)滅菌的萍體，至少清洗4 次，每次3 min，盡量洗去殘留在萍體上的升汞。在立體解剖鏡下用無菌的細(xì)針挑取并棄去包被莖尖的葉片，僅保留莖尖分生組織和1～2 個葉原基，后投入滅菌的IRRI培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)。IRRI培養(yǎng)液的配方為（mg·L-1）：NaH2PO4·H2O 89，K2SO489.1，CaCl2·2H2O 147，MgSO4·7H2O 405.3，MnCl2·4H2O 1.8，Na2Mo2·2H2O 0.38，H3BO31.14，ZnSO4·7H2O 0.04，CuSO4· 5H2O 0.04，CoCl2· 6H2O 0.04，EDTA-Fe（FeSO4· 7H2O 0.249，EDTA 0.261，KOH 0.157，pH 6.5。

以上操作均在組培實驗室的無菌環(huán)境下（蘇凈SW-CJ-2F 型）完成。

培養(yǎng)條件為：26 ℃/18 ℃（日/夜），光強15 000 lx。10～15 d 更新培養(yǎng)液。待繁殖足量后分別稱取樣品用于下一步試驗。

1.2 培養(yǎng)組微生物樣品的制備

稱取培養(yǎng)的滿江紅鮮重材料2.5 g，加入6 mL 的ddH2O 研磨至勻漿，而后取1.5 mL 的滿江紅萍體勻漿液，接種到不同的微生物液體培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，震蕩轉(zhuǎn)速為60 r·min-1，培養(yǎng)時間為7～14 d。本研究選擇最通用的2 種細(xì)菌培養(yǎng)基R2A[20]及TRN[12]對滿江紅的內(nèi)生細(xì)菌進行培養(yǎng)，并設(shè)置以培養(yǎng)滿江紅無藻萍的Nickell[19]培養(yǎng)基為對照。滿江紅內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)組的培養(yǎng)基具體配方見表1。

表1 滿江紅內(nèi)生菌的培養(yǎng)基Table 1 Culture media for endophytic bacteria of Azolla

1.3 培養(yǎng)組樣品DNA 提取與檢測

培養(yǎng)1～2 周后的培養(yǎng)組微生物樣品，經(jīng)離心收集菌體，用于全基因組DNA 的提取。本研究采用Ezup柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒（上海生工），并按說明書的操作步驟進行。提取的DNA 需經(jīng)過質(zhì)檢，構(gòu)建IlluminaPE 文庫的DNA 含量≥2 ng·μL-1，DNA 質(zhì)量 ≥0.25 μg。檢測前將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進行檢測。分別用NanoDrop2000 檢測 DNA 純度，QuantusFluorometer（Picogreen）檢測DNA 含量以及用1% 瓊脂糖凝膠電泳對檢測所提取DNA 的完整性（電壓：120 V，時間：20 min）。

1.4 宏基因組測序與生物信息學(xué)分析

樣品的宏基因組測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在其Illumina 第二代測序平臺MiSeq 上進行，數(shù)據(jù)分析從下機原始序列開始，首先對原始序列進行拆分、質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理。然后使用優(yōu)化序列進行拼接組裝和基因預(yù)測，對得到的基因比對物種數(shù)據(jù)庫NR，以及抗生素相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫ARDB 和CARD，進行抗生素抗性基因功能上的注釋以及分類。宏基因組的數(shù)據(jù)分析在美吉生物科技有限公司的生物云平臺（i-sanger）上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組測序結(jié)果的統(tǒng)計分析

對滿江紅內(nèi)生細(xì)菌3 個培養(yǎng)組的宏基因組測序的有關(guān)數(shù)據(jù)見表2。每個序列的讀長為150 bp，獲得的原始讀數(shù)為101.34～114.87 M；原始的堿基數(shù)為15.30～17.35 G。使用軟件fastp 對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，剪切掉數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量及含N 的reads，從而得到高質(zhì)量的質(zhì)控數(shù)據(jù)（clean data）。獲得質(zhì)控后的讀數(shù)為99.91～113.81 M，質(zhì)控的堿基數(shù)為15.08～17.18 G，本次宏基因組測序共產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)量為48.66 G，質(zhì)控后堿基覆蓋原始堿基數(shù)的98.52%以上。

表2 宏基因組測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計Table 2 Summary of metagenomic sequencing data

在獲得質(zhì)控數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對序列進行組裝和基因預(yù)測，處理結(jié)果見表3。將3 個培養(yǎng)組樣本所獲得的質(zhì)控讀長通過Megahit 進行迭代拼接（overlap），拼接片段（contigs）最短要求為300 bp，各樣本得到1 711～13 482 個拼接片段（contigs）。使用MetaGene進行ORF 預(yù)測。選擇核酸長度大于等于100 bp 的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。不同樣本測得11 813～27 163 個基因，每個樣品基因的平均長度623.17～903.83 bp，覆蓋數(shù)據(jù)量為9.16～16.93 M。將預(yù)測出來的總共54 180 個基因（ORFs）序列使用CD-HIT 軟件進行聚類（參數(shù)為：90% 相似度、90% 覆蓋度）構(gòu)建非冗余基因集（Catalog gene），用于生物信息學(xué)分析。

表3 拼接片段與預(yù)測的功能基因數(shù)據(jù)的統(tǒng)計Table 3 Summary of contigs and predicted genes

2.2 培養(yǎng)的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析

使用 BLASTP 將非冗余基因集與NR 數(shù)據(jù)庫（RefSeq 非冗余蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/）進行比對（BLAST 比對參數(shù)設(shè)置期望值 e-value 為1e-5），并通過 NR 庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋結(jié)果。從所采集的培養(yǎng)樣品中，共注釋出1 712 種微生物物種，使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計算該物種的豐度，在各個分類學(xué)水平上可以統(tǒng)計出物種在各個樣品中的豐度。將注釋到的樣品微生物類別在總門水平和總屬水平上進行分類所得到物種及其豐度見表4，在云平臺分析僅顯示豐度大于0.01閾值的物種名稱時，盡管在總門水平共有38 個門的物種被命名，但通過統(tǒng)計物種豐度發(fā)現(xiàn)：在所有培養(yǎng)樣品中僅變形菌門（Proteobacteria）占比在99.14%以上，其余門占比極低，總豐度僅有0.64%～0.86%?？梢姖M江紅內(nèi)生菌在所選用的3 種培養(yǎng)基中均培養(yǎng)出以變形菌（Proteobacteria）為優(yōu)勢的細(xì)菌。

表4 不同樣本的微生物在門與屬分類水平上的物種豐度Table 4 Microbial community abundance of cultured samples at phylum and genus levels （單位：%）

由表4 可見：3 個樣品中雖然可檢測出712 個物種屬，但其中草螺菌屬（Herbaspirillum）的豐度為91.11%～92.15% ；其次為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia），在各樣本中的占比可達(dá)1.2%左右。其余屬的單屬占比均小于1%，合并總量僅占到7%左右?？梢娫诳倢偎剑? 種所選培養(yǎng)基中滿江紅內(nèi)生菌均繁殖出以草螺菌屬（Herbaspirillum）為優(yōu)勢的細(xì)菌。

2.3 抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫的比對分析

抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫[21]（ARDB，http://ardb.cbcb.umd.edu/）收集了不同環(huán)境來源（如生活廢水、河流等）的細(xì)菌抗藥性基因及其抗性譜、作用機制等注釋信息，為研究藥物作用、環(huán)境治理提供研究依據(jù)。使用 BLASTP 將非冗余基因集與 ARDB 數(shù)據(jù)庫進行比對（比對參數(shù)設(shè)置期望值 e-value 為 1e-5），3 個樣品共注釋到10 個與抗生素有關(guān)的ARG 基因，歸為baca、bcra、bl2a_iii及ceob四大類型（type），涉及桿菌肽（bacitracin）氯霉素（chloramphenicol），和青霉素（penicillin）等3 種抗生素，將樣品中的抗性基因的數(shù)量與相應(yīng)的抗生素類型總結(jié)于表5。由表5中可見：滿江紅內(nèi)生細(xì)菌攜帶的大量抗性基因主要針對2 種抗菌素，一種為桿菌肽，另一種為氯霉素。

表5 樣本中抗生素抗性基因的類型與序列讀長數(shù)Table 5 Types and read amounts of ARGs in cultured samples

綜合抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫CARD[22]（http://arpcard.Mcmaster.ca，Version 1.1.3）廣泛包含了來自各種生物體、基因組、質(zhì)粒的抗生素抗性相關(guān)的參考基因，可用于指導(dǎo)環(huán)境、人體、動物菌群耐藥組和抗生素抗性機制研究。使用 BLASTP 軟件，把非冗余基因集與 CARD 數(shù)據(jù)庫進行比對，比對參數(shù)設(shè)置為“嚴(yán)格（strict）”比對。將目標(biāo)物種的基因與其耐藥功能注釋信息結(jié)合，3 個樣本中總共注釋得到212 個抗生素相關(guān)基因ARO（Antibiotic resistance ontology）。這些抗性基因再依據(jù)CARD 對基因抗性機制的基本分類，主要對應(yīng)于3 個類別（Class）水平：第一類為AR（Antibiotic Resistance）類抗生素抗性基因，它們能直接抵抗抗生素的作用，消除抗生素對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響。3 個樣本中這類抗性基因的豐度均占88%以上；第二類為AS（Antibiotic Sensitive）類抗性基因，它們通過發(fā)生突變、敲除等方式，而賦予菌株抗生素抗性。這類抗性基因在樣本中豐度為7%左右；第三類為AT（Antibiotic Target）類抗性基因，它們是與抗生素作用靶點結(jié)合后，能實現(xiàn)抵抗抗生素的作用，這類抗性基因在樣本中占4%左右；將CARD 注釋的各樣本中的抗性基因ARO 的數(shù)量和抗性機制類別（Class）的豐度總結(jié)于表6 中，由表6可見：3 個樣本檢測到的抗生素抗性基因的機制類別是基本相同的。不僅如此，其中豐度最高的10 個ARO也基本相同，由表7 可見：3 個樣本中豐度最高的ARO 依次為：macB、sav1866、mdtB、PmrB、mexT、PmrA、evgS、adeH、mdtD、rosB。其中PmrA，PmrB為多粘菌素類抗性基因，通過改變細(xì)胞壁的負(fù)荷抵消抗生素作用，其余8 個都是與通過泵的機制將抗生素外排作用有關(guān)的基因。這10 個ARO 均屬于AR類抗性基因。由此可見：本研究檢測到的滿江紅內(nèi)生細(xì)菌主要是以直接抵抗的機制以消除抗生素的作用。

表6 不同樣本中檢測的ARO 抗生素抗性基因的數(shù)量及在抗性機制類別水平的比例Table 6 Amount and classified percentage of detected AROs in cultured samples （單位：%）

表7 不同樣本中前10 位ARO 抗生素抗性基因的序列讀長數(shù)Table 7 Read amounts of top 10 AROs in cultured samples

3 討論與結(jié)論

本研究以培養(yǎng)無共生藻的宿主植物滿江紅的培養(yǎng)基Nickell[19]為對照，利用2 種通用的細(xì)菌培養(yǎng)基R2A,TRN 對小葉滿江紅的內(nèi)生細(xì)菌進行了分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3 種營養(yǎng)成分各異的培養(yǎng)組所培養(yǎng)形成的微生物物種基本是一致的。從門水平上而言，變形菌門（Proteobacteria）的細(xì)菌是其優(yōu)勢種群，推測這些種群的內(nèi)生細(xì)菌很可能在滿江紅共生關(guān)系的營養(yǎng)代謝中起很大的作用。而通常在顯微鏡觀測下占優(yōu)勢的藍(lán)細(xì)菌門微生物在本培養(yǎng)中形成不了優(yōu)勢。從屬水平而言，滿江紅內(nèi)生細(xì)菌群落的優(yōu)勢度則更為的明顯。結(jié)果證明，草螺菌屬（Herbspirillum）可占到全部細(xì)菌菌屬的90%以上，說明它是滿江紅內(nèi)生菌中的一種優(yōu)勢菌種。已知草螺菌屬（Herbaspirillum）是一種常見的植物內(nèi)生菌，多分布于根莖部，且多具合成植物生長素、聯(lián)合固氮等植物促生功能[23]。在富營養(yǎng)的培養(yǎng)基中成為滿江紅一種優(yōu)勢生長的內(nèi)生菌，其機制值得研究。

近年來宏基因組分析技術(shù)在抗生素抗性基因的發(fā)現(xiàn)、傳播機制、進化分析等方面均起到了至關(guān)重要的作用。這得益于兩個方面：一方面，由于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，整合工作流程至產(chǎn)生結(jié)果所花費的時間大大減少，能夠在前所未有的短時間內(nèi)對大群體的微生物進行比較，通過基因組測序，科研工作者可以快速了解目標(biāo)微生物攜帶的耐藥基因和可移動元件等[24]；另一方面是由于抗性基因的生物信息學(xué)分析手段的進步，各類基因分析工具的開發(fā)和抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫的建立[25]。ARDB 是一個人工搜索和校對的方法建立起來的微生物耐藥基因數(shù)據(jù)庫[21]。許多研究采用了ARDB 鑒定抗生素抗性基因[26-27]。本研究通過ARDB 比對，可以檢測到小葉滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的特征耐藥基因是baca與ceob。而CARD 是一個基于志愿者貢獻(xiàn)數(shù)據(jù)的共享平臺[22]，每月更新一次以確保數(shù)據(jù)的時效性。本研究通過CARD 比對，注釋了212 抗生素相關(guān)基因ARO。根據(jù)耐藥機理[28-29]，CARD 將每個ARO 以：產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶（antibiotic inactivation enzyme）破壞抗生素的活性；改變細(xì)胞壁或膜的滲透作用（altering cell wall charge）進而阻礙抗菌藥物的進入；加快細(xì)菌主動外排作用（efflux pump），排出菌體內(nèi)的抗生素；改變抗生素作用靶位（antibiotic target modifying enzyme）等方面進行具體功能描述，但在類別（Class）水平主要分為直接抵抗AR，敏感抵抗AS 和靶點結(jié)合AT 等類別。本研究發(fā)現(xiàn)的滿江紅內(nèi)生細(xì)菌抗生素相關(guān)基因ARO包含了AR，AS 和AT 等3 個類別，且絕大多數(shù)是直接作用的AR 類抗性基因。

本研究通過對小葉滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)，首次結(jié)合宏基因組測序分析，在3 種不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中注釋到了38 門712 屬的物種。這說明宏基因組技術(shù)在對滿江紅內(nèi)生微生物物種基因檢測的廣度和精度方面與前人比都有極大的提升[12-16]，因為只要能檢測到某物種的1 條序列讀長（read），就可以加以注釋。但考慮到基因豐度時，3 種樣本均出現(xiàn)生長優(yōu)勢的特定微生物群落—變形菌門草螺菌屬。鑒于本研究的宿主材料小葉滿江紅的來源單一，又長期在一種環(huán)境下進行種質(zhì)資源保護式的繁殖生長，使得其內(nèi)生細(xì)菌保持較純的原生狀態(tài)。推測草螺菌本是小葉滿江紅的內(nèi)生的原生態(tài)菌之一，且適應(yīng)性及繁殖能力極強，在3 種培養(yǎng)基中均含氮、碳等營養(yǎng)成分時，就可迅速繁殖成優(yōu)勢菌。而其他細(xì)菌，如易在顯微鏡下觀察到的藍(lán)細(xì)菌門的細(xì)菌雖然體型較大，但在培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，競爭不過草螺菌而成為劣勢菌群。對其中抗生素抗性基因的檢測可以進一步推測：正是由于這些單一優(yōu)勢菌群的出現(xiàn)，僅能檢測到滿江紅可攜帶為數(shù)不多的特定的抗生素抗性基因。本研究建立了水生植物滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)程序，并應(yīng)用宏基因組技術(shù)對細(xì)菌的群落組成和所攜帶的抗生素抗性基因進行檢測，為今后利用滿江紅對淡水環(huán)境中的抗生素抗性基因的動態(tài)狀況進行監(jiān)測提供了方法。通過對滿江紅內(nèi)生微生物的特異基因的檢測，也為篩查ARGs 在環(huán)境中依靠水生植物內(nèi)生菌的擴散提供了新的思路。