肖彭卓 楊克平，2

(1 長江大學醫(yī)學院，湖北省荊州市 434023，電子郵箱：305642859@qq.com；2 湖北省荊州市中心醫(yī)院/長江大學第二臨床醫(yī)學院，荊州市 434000)

動脈粥樣硬化引發(fā)的心腦血管病是世界范圍內老年人群致殘和致死的首位因素，其病理機制復雜，從多個角度深入挖掘動脈粥樣硬化的分子生物學機制，尋找更好的防治方法是未來十幾年的一個重要研究方向[1]。巨噬細胞起源于骨髓造血干細胞，可根據(jù)所處內環(huán)境的不同分化為M1和M2兩種亞型，M1型巨噬細胞的功能以抗腫瘤、抗感染為主，而M2型巨噬細胞則以啟動創(chuàng)傷修復和血管新生為主[2-3]。近年來，越來越多的研究證實單核巨噬細胞在動脈粥樣斑塊的發(fā)生和進展中起關鍵作用，動脈粥樣硬化發(fā)生過程中，巨噬細胞的數(shù)量和表型對斑塊的形成和炎癥狀態(tài)有重要影響[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠動脈粥樣硬化病變早期斑塊內巨噬細胞以M2型為主,晚期M1型增多從而使得M1型和M2型巨噬細胞數(shù)量相當[5]，因此，通過調控巨噬細胞極化類型改善血管炎癥，也是改善動脈粥樣硬化患者預后的途徑之一。Sestrin蛋白屬于應激反應蛋白家族，包括Sestrin 1、Sestrin 2和Sestrin 3 3種亞型，在氧化應激、內質網(wǎng)應激盒缺氧應激的情況下均可能被激活。既往研究顯示，Sestrin家族成員能夠影響巨噬細胞的功能[6]，我們的前期研究也證實Sestrin 2對心肌梗死急性期巨噬細胞介導的炎性反應具有調節(jié)作用[7]。但是，動脈粥樣硬化斑塊內的巨噬細胞是否表達Sestrin蛋白，這些Sestrin蛋白對巨噬細胞的極化是否有影響，目前尚未見研究報告。故本研究分析Sestrin 1蛋白對動脈粥樣硬化小鼠巨噬細胞分化的調控作用及對血管內皮炎性損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 無特定病原體級雄性8周齡ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠60只，體質量35～40 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2018-0011。實驗前適應性喂養(yǎng)1周，自由進食進水,飼養(yǎng)環(huán)境為室溫25℃左右、濕度50%～60%、晝夜12 h/12 h交替。小鼠巨噬細胞株RAW 264.7細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要儀器和試劑 (1)主要儀器：細胞培養(yǎng)箱(HF90/240)和生物安全柜(HFsafe-1200LC)購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；倒置顯微鏡(DMi8)購自德國萊卡；高速冷凍離心機(GTR16-2)購自北京時代北利離心機有限公司；垂直電泳(Mini-PROTEIN Tetra System)和電轉印(Trans-Blot Turbo Blotting System)裝置購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；實時熒光定量PCR儀(LightCycle@480)購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。(2)主要試劑：重組對照慢病毒載體質粒(si-NC)和重組Sestrin 1過表達慢病毒載體質粒(si-Sestrin 1)均委托上海吉凱基因科技有限公司合成(批號：201909075)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；批號：1973546)、胎牛血清(批號：1967839)、胰酶(批號：2001132)等細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司；陰離子氯弗松-氯膦酸二鈉脂質體購自上海橋星貿易有限公司(批號：20200103)；油紅O染色液(批號：20190607)、蘇木素染液(批號：20181217)、結晶紫染色液(批號：20181114)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；批號：20200228)、活性氧定量試劑盒(批號：20200107)均購自北京索萊寶科技有限公司；Sestrin 1及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的一抗(批號：GR190316-3、 GR190803-1)以及二抗(山羊抗兔抗體，批號：GR181105-2)均購自Abcam中國官網(wǎng)；蛋白提取試劑盒(批號：20180605)和蛋白定量試劑盒(批號：20192023)購自北京碧云天；總RNA抽提試劑盒(批號：202001011)、反轉錄試劑盒(批號：202001005)、實時熒光定量PCR擴增試劑盒(批號：202002077)購自上海生工生物科技有限公司；引物委托上海生工生物科技有限公司合成；F4/80-PE(批號：202014104)、CD64-PerCP-Cy5.5(批號：201905144)、CD197-PerCP-Cy5.5(批號：201903003)、CD163-Alexa 647(批號：202003015)、CD206-Alexa 647(批號：201912033)等熒光標記抗體均購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3 冠狀動脈粥樣硬化模型制備方法 按照體重由小到大編號，采用區(qū)組隨機化法將ApoE-/-小鼠分為對照組、模型組、si-NC組和si-Sestrin 1組，每組15只。對照組正常飼養(yǎng)，模型組、si-NC組和si-Sestrin 1組小鼠均采用高脂飲食法制備冠狀動脈粥樣硬化模型，即使用含有21%脂肪和0.15%膽固醇的高脂飼料。連續(xù)飼養(yǎng)14周后，各組隨機抽取5只小鼠用于觀察模型制備情況：采用3.0%的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射處死小鼠，分離胸主動脈，并浸泡于4%的多聚甲醛溶液中過夜，制備常規(guī)石蠟病理切片；經蘇木精-伊紅染色后觀察胸主動脈形態(tài)，出現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化的病理特征者，例如血管內膜有大片斑塊、泡沫細胞堆積、部分斑塊破裂等，視為模型制備成功。確定模型制備成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，并進行下一步的RAW 264.7細胞干預。

1.4 RAW 264.7細胞培養(yǎng)與模型干預方法 采用24孔板培養(yǎng)RAW 264.7細胞，培養(yǎng)基為含10%的新生小牛血清及100 U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0.25%胰酶消化1 min，更換培養(yǎng)基。調整細胞密度為5×106個/mL，將慢病毒載體質粒si-NC或si-Sestrin 1(按8 μg：1 mL的比例)分別與si-NC組和si-Sestrin 1組細胞共培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育24 h。次日更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，0.25%胰酶消化后收集細胞，PBS清洗，熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社，型號：BX41)下觀察轉染情況，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光為轉染成功。轉染率達到90%以上時，可對si-NC組和si-Sestrin 1組小鼠進行細胞干預。首先清除si-NC組和si-Sestrin 1組小鼠體內原有的巨噬細胞，即經尾靜脈注射0.1 mL的陰離子氯弗松-氯膦酸二鈉脂質體，對照組和模型組經尾靜脈注射等體積的生理鹽水，3 d后重復注射1次；末次注射3 d后，si-NC組和si-Sestrin 1組小鼠經眼球后靜脈叢注射轉染后的RAW 264.7細胞，濃度為5×106個/mL，注射體積為0.2 mL，對照組和模型組小鼠僅注射0.2 mL DMEM，24 h后重復輸注1次，并于第2次輸注24 h后處死小鼠進行取樣和相關指標檢測。

1.5 指標測定方法

1.5.1 斑塊定量和斑塊內活性氧活性測定：分離腹主動脈，剔除其周圍結締組織和脂肪組織，4%的多聚甲醛浸泡過夜，剪開血管內壁，采用0.3%的油紅O溶液避光染色2 h，PBS清洗，75%乙醇浸泡。斑塊呈紅色、動脈壁底色呈白色時，顯微鏡下觀察并拍照，采用圖像分析軟件Image J計算總斑塊面積。剝離斑塊，經PBS溶解后置于離心管，4℃下1 000 r/min離心5 min，收集上清，采用活性氧定量試劑盒測定斑塊內活性氧活性，按說明書中的步驟進行操作。將所得下層細胞再次用PBS重懸，離心(每次均1 000 r/min，5 min)洗滌兩次，分離細胞，洗滌后用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，用于巨噬細胞的分離及極化。

1.5.2 斑塊巨噬細胞的分離及極化：(1)采用DMEM培養(yǎng)基重懸下層細胞后，調整細胞密度為1×106個/mL，接種于6孔板中培養(yǎng)，2 mL/孔，于5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁細胞為斑塊巨噬細胞。(2)向巨噬細胞中加入終濃度為10 ng/mL的γ-干擾素(北京索萊寶，批號：20200106)，5% CO2、37℃培養(yǎng)6 d，誘導巨噬細胞向M1型分化，并采用流式細胞儀測定M1型巨噬細胞表型CD64、CD197陽性率；采用實時熒光定量PCR法測定M1型巨噬細胞標志物腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的mRNA表達量。(3)向巨噬細胞中加入終濃度為10 ng/mL的IL-4，5% CO2、37℃培養(yǎng)6 d，誘導巨噬細胞向M2型分化，并采用流式細胞儀測定M2型巨噬細胞表型CD163、CD206陽性率；實時熒光定量PCR法測定M2型巨噬細胞標志物IL-10及轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的mRNA表達量。

1.5.3 流式細胞儀測定巨噬細胞表型：巨噬細胞與相應的誘導劑共培養(yǎng)6 d后，重懸于DMEM，1 200 r/min離心10 min，棄上清，再次重懸于DMEM，調整細胞數(shù)至1×105個/mL，取2 mL置于流式管中，300 r/min離心5 min，棄上清，重懸于100 μL PBS，依次加入相應的熒光標記抗體(F4/80-PE、CD64-PerCP-Cy5.5、CD197-PerCP-Cy5.5、CD163-Alexa 647、CD206-Alexa 647等)，于4℃避光孵育30 min后，加入2 mL PBS洗滌細胞，300 r/min離心10 min，棄上清，再加入0.2 mL PBS重懸細胞，200目濾網(wǎng)過濾細胞后上機檢測。

1.5.4 實時熒光定量PCR實驗測定巨噬細胞標志物表達：無菌操作臺上工作，采用TRIzol法提取巨噬細胞的總RNA，蛋白核酸分析儀分析RNA質量。質量合格者納入反轉錄實驗，根據(jù)試劑盒配置反轉錄體系，將反應管置入PCR儀中，設置反應條件，37℃×15 min，85℃×5 s，4℃存儲。根據(jù)實時熒光定量 PCR 試劑盒配置擴增體系，包括ddH2O 15 μL、10×Taq 2.5 μL、dNTP Mix 2.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL、Taq DNA Polymerase 0.3 μL、DNA模板1.0 μL。管家基因為GAPDH，引物序列見表1。PCR反應步驟為95℃×30 s預變性，95℃×5 s、60℃×30 s共40個循環(huán)，擴增，50℃×30 s退火。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.5.5 蛋白質免疫印跡實驗測定Sestrin 1蛋白表達：采用蛋白抽提試劑盒提取巨噬細胞的總蛋白，二喹啉甲酸法進行蛋白定量，并采用buffer緩沖液將蛋白配置為1 μg/μL的溶液。以10 μL/孔為上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將凝膠中的蛋白條帶轉印至羥甲基纖維素膜。5%脫脂牛奶于37℃封閉纖維素膜1 h。采用3%的脫脂牛奶配置抗體，根據(jù)說明書及預實驗結果，Sestrin 1與GAPDH的一抗?jié)舛染鶠? ∶2 000，孵育條件為4℃過夜；二抗?jié)舛葹? ∶2 500，孵育條件為37℃×1 h。電化學發(fā)光液顯色，暗室顯影，Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值作為該蛋白的表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠胸主動脈斑塊測定結果 與對照組相比，其他3組的斑塊面積增加，斑塊內活性氧活性也升高(均P<0.05)；與模型組相比，si-Sestrin 1組的斑塊面積增加，斑塊內活性氧活性升高(均P<0.05)，但si-NC組的指標與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠胸主動脈斑塊面積和活性氧活性的比較(±s)

2.2 各組大鼠Sestrin 1蛋白相對表達量的比較 與對照組相比，其他3組Sestrin 1蛋白表達量降低(P<0.05)；與模型組相比，si-Sestrin 1組Sestrin 1蛋白表達量降低(P<0.05)，但si-NC組的蛋白表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表3。

圖1 4組小鼠胸主動脈斑塊Sestrin 1蛋白表達情況

表3 各組小鼠胸主動脈斑塊Sestrin 1蛋白相對表達量的比較(±s)

2.3 各組巨噬細胞表面標志物測定結果 與對照組相比，其他3組M1型巨噬細胞表面標志物CD64和CD197的陽性表達率升高，M2型巨噬細胞表面標志物CD163和CD206的陽性表達率降低(均P<0.05)；與模型組比較，si-Sestrin 1組的CD64和CD197陽性表達量升高，CD163和CD206陽性表達率降低(均P<0.05)，但si-NC組的巨噬細胞表面標志物與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠巨噬細胞表面標志物陽性率的比較(±s，%)

2.4 各組細胞因子mRNA相對表達量的比較 與對照組相比，其他3組iNOS的mRNA表達量升高，TGF-β和IL-10的mRNA表達量降低(均P<0.05)；與模型組比較，si-Sestrin 1組iNOS的mRNA表達量升高，TGF-β和IL-10 mRNA表達量降低(均P<0.05)，但si-NC組的上述指標的mRNA表達量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表5。

表5 各組細胞因子mRNA相對表達量的比較(±s)

3 討 論

Sestrin家族屬于抗氧化蛋白，在進化方面高度保守，普遍分布于哺乳動物的組織、器官及外周循環(huán)系統(tǒng)。Sestrin 1也稱p53調控蛋白26(PA26)，Sestrin 2是Sestrin 1的同源異構體，Sestrin 3是后來發(fā)現(xiàn)的一種PA26結構相關基因，三者在功能上并不完全相同[8]。例如，在濾泡性淋巴瘤中，Sestrin 1表達明顯偏低且被鑒定為一種抑癌基因，而Sestrin 2和Sestrin 3表達卻無明顯變化[9]。在腫瘤性疾病中，缺氧刺激可同時激活Sestrin 1與Sestrin 2，而在能量匱乏導致的缺氧條件下往往只有Sestrin 2被激活[10]。 Keping等[11]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化小鼠的巨噬細胞中Sestrin 1與Sestrin 2表達均明顯升高，且采用慢病毒轉染技術上調Sestrin 1表達后，對氧化修飾的LDL誘導的炎性反應有明顯的抑制效果，這表明Sestrin 1在動脈粥樣硬化中可能發(fā)揮抗血管炎性損傷的作用。本研究結果顯示動脈粥樣硬化小鼠的斑塊中巨噬細胞Sestrin 1蛋白表達明顯降低，這與Keping等[11]報告的結果有所不同。這可能是因為：Keping等[11]是在模型制備成功后立即檢測Sestrin 1表達水平，而本研究是在模型制備成功后14 d測定Sestrin 1表達水平；作為一種應激蛋白，Sestrin 1在應激早期被激活，表達量上調，但隨著疾病進展，其表達水平達到峰值后開始降低。我們對小鼠斑塊的相關指標進行檢測，結果顯示，模型組的斑塊面積增加，且斑塊內活性氧的活性也升高，采用干擾技術降低Sestrin 1表達后斑塊面積及斑塊內活性氧活性進一步升高，這提示下調Sestrin 1表達利于控制氧化應激反應，從而減少斑塊形成。

既往研究已證實，巨噬細胞極化類型與動脈粥樣硬化的病理狀態(tài)息息相關，在動脈粥樣硬化病變早期斑塊內巨噬細胞以M2型細胞為主，其主要作用是促進血管內皮損傷后修復，隨著病情加重，到疾病的晚期M1型巨噬細胞增多，血管內皮出現(xiàn)炎性損傷[12-13]。目前，如何鑒別巨噬細胞的極化類型并無統(tǒng)一標準，部分研究采用M1型與M2型巨噬細胞的常見細胞表面標志物，也有部分研究采用其分泌的細胞因子，其中前者側重于細胞表型鑒定，后者側重于功能考察[14-15]。CD64和CD197是M1型巨噬細胞的表面標志物；CD163和CD206是M2型巨噬細胞的表面標志物，其中CD163被認為是巨噬細胞由M1型向M2型轉化的典型標志[16]。為考察巨噬細胞的極化能力，本研究以γ-干擾素誘導巨噬細胞向M1型分化，測定M1型巨噬細胞的表面標志物，再以IL-4誘導巨噬細胞M2型分化，測定M2型巨噬細胞的標志物。結果顯示，與對照組相比，模型組CD64和CD197的陽性表達率升高，CD163和CD206的陽性表達率降低；與模型組比較，si-Sestrin 1組的CD64和CD197陽性表達率升高，CD163和CD206陽性表達率降低。該結果從細胞表型方面證實了動脈粥樣硬化小鼠斑塊中的巨噬細胞向M1型的極化能力增強，且沉默Sestrin 1蛋白表達后，這一病理現(xiàn)象更加嚴重。既往有學者指出，在炎癥調節(jié)方面，M1型巨噬細胞能夠分泌iNOS、TNF-α等促炎因子，從而激活獲得性免疫系統(tǒng)；而M2型巨噬細胞則以分泌IL-10為主，以抑制免疫炎性反應，從而給組織創(chuàng)傷后修復提供良好的環(huán)境[17-18]。本研究結果還顯示，與對照組相比，模型組iNOS mRNA表達水平升高，TGF-β和IL-10的mRNA表達水平降低，沉默Sestrin 1表達后，這一變化也進一步加劇。該結果從功能方面證實了動脈粥樣硬化小鼠斑塊中的巨噬細胞向M1型的極化能力增強，且沉默Sestrin 1蛋白表達后，這一病理現(xiàn)象加重。

結合在病情進展后期動脈粥樣硬化小鼠體內Sestrin 1表達低下的情況，本研究推測Sestrin 1不足可能是造成動脈粥樣硬化血管內炎性反應的一個重要原因，且巨噬細胞的極化作用可能參與其中。巨噬細胞向M1型還是向M2型分化，主要是受到局部免疫微環(huán)境的影響。作為一種應激反應蛋白，Sestrin 1在機體受到氧化應激損傷或者炎性損傷時能夠迅速作出反應，并激活一系列應激相關信號來抵抗這種損傷，Sestrin 1功能的缺失可能導致促炎細胞因子的持續(xù)產生，從而影響到巨噬細胞的極化，其具體調控機制有待進一步研究加以證實。

綜上所述，Sestrin 1蛋白表達下調可促進動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞的極化，并由此參與內皮細胞的炎性損傷，這可能是其參與動脈粥樣硬化進展的重要機制之一。