李青原，李 靜，魏 鑫，孫美秀

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所激光醫(yī)學實驗室，天津 300192

引 言

作為一種高豐度的內(nèi)源性碳氫化合物，異戊二烯(Isoprene，C5H8)廣泛存在于人體的呼吸氣體之中[1]，Jansson和Larsson于1969年報道了人體呼吸氣體中異戊二烯的存在[2]，含量約為(50～200)×10-9[3]。研究表明，異戊二烯含量與人體血液中的膽固醇水平存在關(guān)聯(lián)[4]，呼氣異戊二烯含量會在不同的臨床特定疾病和生理條件下發(fā)生變化，例如年齡、 性別、 運動和肺癌[5-6]等因素。迄今為止，尚不能從個別研究中得出關(guān)于呼氣異戊二烯水平與人體血液中的膽固醇水平的定量相關(guān)性。因此，開發(fā)高靈敏度、 高選擇性、 高精度、 可以用于實時、 在線呼氣異戊二烯分析儀，可以針對大規(guī)模特定人群進行呼氣數(shù)據(jù)采集，為呼氣異戊二烯含量與人體血液中的膽固醇水平的定量相關(guān)性提供參考依據(jù)。

目前報道測量呼氣異戊二烯的研究使用了氣體傳感器和光腔衰蕩光譜(cavity ringdown spectroscopy, CRDS)。如Perez-Guaita等使用中空波導傳感器實現(xiàn)了檢測極限(limit of detection，LoD)為106×10-9[7]。Song等使用氣體傳感器測量異戊二烯的LoD為420×10-9[8]?；谧贤鈪^(qū)的CRDS，Sahay等[9]在266 nm處測量了異戊二烯，LoD為4×10-6。由于異戊二烯在人體呼吸氣體中含量較低，要想實現(xiàn)高精度的呼氣異戊二烯的檢測，至少需要達到10-9量級的檢測極限，然而以上研究都沒有達到理想的檢測極限。

CRDS[10]以其高靈敏度、 高選擇性、 實時在線分析的特點，為呼吸氣體分析領(lǐng)域的研究提供了一種實現(xiàn)實時在線分析的可行性技術(shù)，符合呼吸氣體分析未來發(fā)展的需求，相比于質(zhì)譜技術(shù)，它具有便攜、 操作簡單的特性，相比于電化學方法，它具有高靈敏、 高精度的特點，這些優(yōu)點使得CRDS十分適合于人體呼吸氣體中的異戊二烯的實時在線測量。

本研究采用目前市場在售的單波長緊湊型半導體紫外激光器，選擇224 nm的紫外激光作為呼氣異戊二烯的探測光源，搭建了一套基于CRDS的呼氣異戊二烯分析儀，測量了分析儀的典型光腔衰蕩信號，對分析儀的穩(wěn)定性、 重復性、 響應(yīng)時間和線性響應(yīng)等性能進行了評估。

1 實驗部分

1.1 原理

本節(jié)簡述CRDS的基本原理，使用兩個高反鏡構(gòu)成一個高品質(zhì)因數(shù)的光學諧振腔，讓一束單縱模激光平行入射并在腔內(nèi)來回反射，由于腔鏡反射率極高，大于99.9%的激光都會在諧振腔內(nèi)往復反射，只有不到0.1%的激光可以透射出腔外。根據(jù)Beer-Lambert定律，從第二個高反鏡透射出來的激光強度將按照單指數(shù)規(guī)律衰減，擬合后可分別得到腔內(nèi)為真空以及存在待測氣體時的衰蕩時間常數(shù)τ0和τ，吸收強度A為

(1)

式(1)中，c為光速，σ(ν)為氣體樣本在波長ν處的吸收截面，n為物質(zhì)的粒子數(shù)密度，d為腔長。

采用背景扣除法[11]測量呼氣異戊二烯濃度，即在224 nm把空氣看作人體呼吸的背景，從呼吸樣本的吸收強度中扣除背景空氣中某些干擾組分的有效吸收，交替測量背景空氣和呼吸樣本的衰蕩時間τair和τbreath，得到呼吸樣本中異戊二烯的濃度，對式(1)變形后可以得到式(2)

(2)

1.2 裝置

呼氣異戊二烯分析儀包括四個主要組成部分： 激光系統(tǒng)、 真空腔體、 光電探測模塊以及數(shù)據(jù)采集模塊(見圖1)。使用Nd∶YAG激光器(Powerlite DLS 8020，美國)產(chǎn)生的355 nm激光對染料激光器(SpectraPhysics, 美國)進行泵浦，再經(jīng)過二倍頻后產(chǎn)生波長為224 nm的激光，脈寬5～7 ns, 單脈沖能量約為10 μJ，重復頻率為20 Hz。

真空腔體由長50 cm的不銹鋼腔體(CRD Optics，美國)一對，用來固定和調(diào)整反射鏡準直的反射鏡架(CRD Optics，美國)以及一對高反鏡(MLD，R>99.8%，曲率半徑=1 m)組成。不銹鋼腔體內(nèi)表面采用硅烷化惰性處理以避免氣體殘留帶來的影響。鏡架和反射鏡之間采用O形膠圈進行密封和緩沖。衰蕩腔上連接三個內(nèi)徑為0.635 cm的不銹鋼管，分別接入氣體樣本、 真空泵(SCROLLVAC SC5D，德國)和壓力傳感器(MKS 870B，美國)。使用兩個三通閥控制氣體樣本和真空泵的不銹鋼管的開關(guān)，將兩個三通閥的第一個出口堵死，兩個三通閥的第二個出口分別接入氣體樣本和真空泵，最后剩下的第三個出口連接兩個不銹鋼管。

使用光電倍增管(HAMAMATSU，日本)采集衰蕩信號，選擇放大器將光電倍增管輸出的高頻電流信號轉(zhuǎn)換為電壓信號后，通過數(shù)字示波器(Tektronix，美國)將信號數(shù)字化后傳輸至計算機，使用自行開發(fā)的集成化軟件系統(tǒng)對衰蕩信號進行擬合，并完成數(shù)據(jù)收集和處理。

高純氮氣(天津安興工業(yè)氣體，>99.999%)，異戊二烯標準氣體(大連大特氣體)，丙酮、 一氧化氮和一氧化二氮標準氣體均為北京氦普北分氣體。人體呼出氣體來自一名健康受試者。使用容積為1 000 mL的特氟龍氣體采樣袋收集和存儲氣體樣本(北京浩辰天誠環(huán)?？萍加邢薰?。整個實驗過程保持常溫常壓。

圖1 呼氣異戊二烯分析儀示意圖Fig.1 Schematic of the breath isoprene analyzer

2 結(jié)果與討論

2.1 呼氣異戊二烯分析儀的典型衰蕩曲線

為了確保腔體內(nèi)氣體吸收遵守朗伯-比爾定律，本節(jié)對呼氣異戊二烯分析儀的真空下的衰蕩信號進行了測量。圖2(a)顯示了在真空下記錄的典型衰蕩信號，呈現(xiàn)指數(shù)衰減。對擬合段進行對數(shù)運算，將圖2(a)中的X軸和Y軸之間的關(guān)系從指數(shù)函數(shù)變?yōu)榫€性函數(shù)，在圖2(b)中，擬合結(jié)果顯示出良好的線性度，表明該分析儀獲得的衰蕩信號接近單指數(shù)衰減(R2=0.998 39)，符合朗伯-比爾定律。

圖2 典型真空衰蕩曲線的單指數(shù)擬合(a)： 典型真空衰蕩曲線；(b)： 對圖2(a)數(shù)據(jù)的線性擬合Fig.2 The fitting of the data of typical ringdowndecay waveform under vacuum(a) The typical ringdown decay waveform under vacuum; (b) The fitting of the data in Figure 2 (a)

2.2 平均次數(shù)對呼氣異戊二烯分析儀穩(wěn)定性的影響

由于光電檢測器和示波器的分辨能力有限，在信號采集的過程中會引入電子噪聲，實驗中通過對信號平均來降低噪聲影響，平均后的信號穩(wěn)定性更好。然而并不是信號平均次數(shù)越多越好，隨著信號的平均次數(shù)增大，增大的數(shù)據(jù)量會降低傳輸處理速度，出現(xiàn)延遲反應(yīng)。

為了找到合適的平均次數(shù)，記錄了腔體為真空狀態(tài)時，衰蕩信號在6種平均次數(shù)下的分析儀穩(wěn)定性，分別如圖3(a—f)所示，其中橫坐標為數(shù)據(jù)個數(shù)，縱坐標為衰蕩時間。表1給出了6種平均次數(shù)下的衰蕩時間均值、 標準差和相對標準差，相對標準差代表了分析儀的穩(wěn)定性，定義為一段時間內(nèi)衰蕩時間常數(shù)的標準差與均值之比。當信號平均次數(shù)為2時，可以看見衰蕩時間明顯的波動，穩(wěn)定性隨著平均次數(shù)的增大而增大，當信號平均次數(shù)為128時，穩(wěn)定性已經(jīng)達到了0.36%，當信號平均次數(shù)為512時，穩(wěn)定性最高，為0.14%。一般認為，當衰蕩信號的穩(wěn)定性在5%以下，已經(jīng)達到一個良好、 穩(wěn)定、 可以使用的狀態(tài)。綜合考慮衰蕩信號的穩(wěn)定性和分析儀的響應(yīng)時間，采用128次作為實驗過程中的信號平均次數(shù)。

表1 不同平均次數(shù)的衰蕩信號穩(wěn)定性Table 1 Ringdown signal stability undersix average times

圖3 不同信號平均次數(shù)腔衰蕩時間穩(wěn)定性(a)： 平均次數(shù)為2； (b)： 平均次數(shù)為16； (c)： 平均次數(shù)為64；(d)： 平均次數(shù)為128； (e)： 平均次數(shù)為256； (f)： 平均次數(shù)為512Fig.3 Ringdown signal stability under six average times(a)： Average time is 2; (b)： Average time is 16; (c)： Average time is 64; (d)： Average time is 128; (e)： Average time is 256; (f)： Average time is 512

2.3 穩(wěn)定性與檢測極限

圖4為持續(xù)測量了16 min的真空衰蕩時間常數(shù)，所得數(shù)據(jù)的平均值為0.908 μs，標準差為0.004 39 μs，穩(wěn)定性為

圖4 呼氣異戊二烯分析儀穩(wěn)定性Fig.4 Evaluation of the ringdown baseline stabilityof the breath isoprene analyzer

0.48%。使用3-σ準則確定分析儀的LoD為0.49×10-9，提高為以往研究的1/1 000，足以滿足臨床測量需求。此外，降低對高反鏡反射率的要求可以實現(xiàn)大幅減少儀器成本的目標，在本實驗中當高反鏡的反射率為99.5%時，仍然可以實現(xiàn)1.35×10-9的檢測極限。

2.4 重復性和響應(yīng)速度

測量了呼氣異戊二烯分析儀對不同樣本(氮氣、 空氣和呼吸樣本)的實際響應(yīng)，每個樣本均測試兩次，由圖5可見分析儀對于同一種氣體的響應(yīng)始終保持一致，當腔體再次恢復到真空時，衰蕩時間仍然可以恢復到同一水平。并且在頻繁的抽氣和進氣過程中，氣壓的急劇變化并沒有影響諧振腔的穩(wěn)定。另外，從圖5中可見，每次改變氣體種類時，每個單位的上升沿和下降沿很陡，變化的過程在數(shù)秒內(nèi)達到了穩(wěn)定，說明分析儀的響應(yīng)速度很快。因此，該分析儀具有良好的重復性、 穩(wěn)定性以及近實時的響應(yīng)速度(數(shù)秒量級)。

圖5 呼氣異戊二烯分析儀的重復性和響應(yīng)速度Fig.5 The breath isoprene analyzer shows goodreproducibility and fast response

2.5 線性度

為了測試呼氣異戊二烯分析儀的線性度，測量了不同粒子數(shù)密度的異戊二烯標準氣體的衰蕩時間，計算出相應(yīng)的吸收強度，并記錄每點的誤差幅度。每個粒子數(shù)密度均重復測量50次。測量結(jié)果如圖6所示，橫軸顯示異戊二烯標準氣體的粒子數(shù)密度介于(10～200)×10-9，縱軸為相應(yīng)的吸收強度，二者之間的線性相關(guān)系數(shù)為0.993 13，圖中五個測試點的誤差棒的不確定度為±2%，證明該分析儀對不同粒子數(shù)密度的異戊二烯標準氣體具有線性響應(yīng)特性。

圖6 呼氣異戊二烯分析儀對不同粒子數(shù)密度的異戊二烯標準氣體的線性響應(yīng)

2.6 不同氣體分子在224 nm的吸收情況

為了進一步驗證可能存在的對異戊二烯測量的光譜干擾問題，實驗中測量了以下幾種腔體狀態(tài)在224 nm下的吸收情況： 當腔體為真空時，以及當腔內(nèi)分別充入N2、 1×10-6NO、 20×10-9N2O、 3×10-6丙酮、 背景空氣、 50×10-9異戊二烯、 一位健康受試者的呼吸氣體至一個大氣壓，其中使用的NO、 N2O和丙酮標準氣體的濃度代表了這三種氣體在人呼出氣體中的含量。如圖7所示，當腔內(nèi)為真空時，吸收強度近乎為零(0.002 29×10-3)。當N2充入腔內(nèi)，吸收強度為0.308 18×10-3，由于N2在此處并無吸收，此時吸收強度是由于瑞利散射導致的，如果氣體分子沒有吸收，那么它們在同一波長處的散射損耗是相同的，因此將腔內(nèi)充滿N2至一個大氣壓的吸收強度(0.308 18×10-3)作為基線吸收強度。將1×10-6NO、 20×10-9N2O和3×10-6丙酮充入腔體后，吸收強度分別為0.313×10-3，0.437×10-3和0.316×10-3，與基線吸收強度相比，NO、 N2O和丙酮在224 nm沒有明顯的吸收，微弱的吸收可以忽略不計，因此，可以認為在224 nm的吸收主要是由于異戊二烯導致的。充入背景空氣的吸收強度(2.105×10-3)小于50×10-9異戊二烯的吸收強度(5.34×10-3)，說明異戊二烯在此處具有很強的吸收。充入一個大氣壓的呼吸氣體造成的吸收最強，為10.16。以上分析證實了使用背景扣除法，該分析儀能夠在224 nm測定實際人呼出氣體中的痕量異戊二烯。

圖7 吸收強度對比Fig.7 Comparison of absorbance

3 結(jié) 論

基于目前市場在售的單波長緊湊型半導體紫外激光器，搭建了一套基于CRDS的呼氣異戊二烯分析儀，該分析儀主要由激光系統(tǒng)、 真空腔體、 光電探測模塊以及數(shù)據(jù)采集模塊構(gòu)成。該呼氣異戊二烯分析儀具有高的靈敏度、 重復性、 穩(wěn)定性、 近實時的響應(yīng)速度和良好的線性度(R2=0.993 13)。同時分析了在224 nm測量異戊二烯存在的光譜干擾問題(NO，N2O和丙酮)。研究表明基于CRDS的便攜式呼氣異戊二烯分析儀可實現(xiàn)對人體呼氣異戊二烯的有效分析，適合于開展大規(guī)模的人體呼氣實驗，為呼氣異戊二烯含量與人體血液中的膽固醇水平的定量相關(guān)性提供參考依據(jù)。