郭乃妮，鄭敏燕，趙維，紀(jì)思媛，曾睿，李敏

（咸陽師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院,陜西咸陽 712000）

天然產(chǎn)物廣泛地存在于自然界中，種類眾多，許多天然產(chǎn)物具有驚人的生理效能。從常見的植物中提取天然產(chǎn)物，對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行分離、提純、鑒定和結(jié)構(gòu)分析，尋求具有特殊結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特別是用于人類健康的天然產(chǎn)物是有機(jī)化學(xué)及實(shí)驗(yàn)中一個(gè)十分活躍的領(lǐng)域[1，2]。

有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的萃取、蒸餾、結(jié)晶等是天然產(chǎn)物分離提取的基礎(chǔ)方法，隨著色譜技術(shù)的不斷發(fā)展薄層層析、柱層析、氣液色譜及高效液相色譜等已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取[3-5]。綠色植物如菠菜中含有葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素等多種天然色素，通過菠菜色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)可以使學(xué)生對(duì)天然產(chǎn)物的分離提取有一定認(rèn)識(shí)和理解，有助于培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能，提高學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和綜合能力[6]。但是傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法在對(duì)葉黃素、葉綠素和胡蘿卜素分離的柱層析實(shí)驗(yàn)操作中，存在著液體色素添加不均勻、水分較多、時(shí)間受限、層析效果不佳等問題[7-9]，研究通過采用把菠菜色素的提取濃縮液和柱層析法所用吸附劑載體中性氧化鋁混合攪拌均勻，在紅外線烘箱中烘干后，進(jìn)行色素柱層析操作，可以有效地提高柱層析色素的分離效果，該優(yōu)化研究使胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素分離更快速、精確，提高了分析效果，有效地提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

1 實(shí)驗(yàn)原理

菠菜中含有葉綠素（綠色）、胡蘿卜素（橙色）、葉黃素（黃色）等多種天然色素，這幾種色素結(jié)構(gòu)均屬共軛多烯的衍生物。葉綠素以葉綠素a(C55H72O5N4Mg)和葉綠素b(C55H70O6N4Mg)兩種相似的結(jié)構(gòu)存在，結(jié)構(gòu)如圖1和2所示，均為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，是綠色植物光合作用的必需催化劑，大烴基結(jié)構(gòu)的存在使葉綠素易溶于丙酮、乙醇、石油醚等有機(jī)溶劑。

圖1 葉綠素a結(jié)構(gòu)Fig.1 structure of chlorophyll a

圖2 葉綠素b結(jié)構(gòu)Fig.2 structure of chlorophyll b

胡蘿卜素(C40H56)是一類長(zhǎng)鏈共軛多烯，結(jié)構(gòu)如圖3所示，易溶于氯仿、苯和石油醚。胡蘿卜素具有維生素A的生理活性，可作為食品工業(yè)中的色素使用，無毒安全，是一種抗氧化劑，具有解毒作用，在抗癌、預(yù)防心血管疾病等方面有顯著的功能，并進(jìn)而防止老化和衰老引起的多種退化性疾病，是維護(hù)人體健康不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素。

圖3 胡蘿卜素結(jié)構(gòu)Fig.3 structure of carotene

葉黃素(C40H56O2)是胡蘿卜素的羥基衍生物，又稱類胡蘿卜素，結(jié)構(gòu)如圖4所示，含量通常是胡蘿卜素的2倍，與胡蘿卜素相比較易溶于乙醇而在石油醚中溶解度較小。葉黃素本身是一種抗氧化物，并可以吸收藍(lán)光等有害光線，對(duì)光氧化、光破壞具有保護(hù)作用，是構(gòu)成人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素。

圖4 葉黃素結(jié)構(gòu)Fig.4 structure of lutein

吸附柱層析法是分離、提純和鑒定有機(jī)物的重要方法，本研究采用將菠菜色素的提取濃縮液和柱層析吸附劑載體中性氧化鋁先均勻攪拌混合，再在紅外線烘箱中充分烘干，最后用烘干拌勻的含色素的固體氧化鋁進(jìn)行柱層析操作。該實(shí)驗(yàn)的固體色素分離法利用色素能均勻分層，并且胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素因極性差異在柱層析層析液中溶解度和分離速度的不同實(shí)現(xiàn)主要色素的快速、精確分離提純。主要色素依次分離的順序?yàn)椋汉}卜素（橙色）、葉黃素（黃色）、葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色）。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

儀器：FA2004型電子分析天平（常州德普紡織科技有限公司），UV-240紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司），ZK-072型真空干燥箱（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司），層析柱（20×1.0cm），研缽，蒸餾燒瓶，冷凝管，抽濾瓶，燒杯，量筒。

試劑：中性氧化鋁（150～160目）、乙醇（95%）、石油醚、丙酮、丁醇、甲醇、無水Na2SO4，以上均為分析純?cè)噭?；新鮮菠菜。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

菠菜色素的提取分離過程如圖5所示。

圖5 菠菜色素的提取分離

2.3 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程

2.3.1 菠菜色素的提取

稱取20 g新鮮干凈無水的菠菜葉，剪碎后與20 mL的甲醇拌勻后在研缽中仔細(xì)研磨2～5 min，用布氏漏斗抽濾，棄去濾液后將糊狀菠菜葉放回研缽，用10 mL體積比3∶2的石油醚-甲醇混合液萃取兩次，每次輕輕研磨并抽濾，將所得深綠色萃取液合并后轉(zhuǎn)入分液漏斗，用20 mL的蒸餾水分兩次輕輕振蕩萃取除去甲醇，分液后取上層液體加入無水Na2SO4干燥，再通過水浴蒸餾除去大部分石油醚，得1 mL深綠色濃縮色素提取液。

2.3.2 菠菜色素的分離

采用柱層析法進(jìn)行菠菜色素的分離，具體操作規(guī)程如下：

在20×1.0 cm的層析柱中加入10 cm高的石油醚，用玻璃漏斗緩慢加入適量中性氧化鋁（150～160目），同時(shí)打開層析柱下邊旋塞，邊加邊用小木棒敲打?qū)游鲋３謱游鲋鶅?nèi)石油醚液面高度不變，保證吸附劑緊密均勻平整。裝完層析柱后打開下端旋塞，放出部分石油醚使得氧化鋁表面石油醚層高度剩余1～2 mm即可。

將所得的1 mL深綠色濃縮色素提取液與氧化鋁攪拌均勻，在65℃條件下真空干燥后用玻璃漏斗加入上述層析柱頂部，打開層析柱下端旋塞使石油醚液面下降至柱面以下1 mm后，關(guān)閉旋塞，再?gòu)捻敹擞玫喂艿渭邮兔押笤俅未蜷_下端旋塞，使液面下降至柱面下1 mm左右，重復(fù)操作數(shù)次使得色素全部進(jìn)入柱體。

配制石油醚-丙酮（9∶1）的洗脫劑50 mL，用滴液漏斗在層析柱上面逐滴加入洗脫劑，打開層析柱下端旋塞逐滴放出洗脫劑，層析開始，用錐形瓶收集得到的第一個(gè)橙黃色樣品色素即為胡蘿卜素；再用配制的石油醚-丙酮（7∶3）作洗脫劑，分出的黃色樣品色素即為葉黃素；最后用配制的丁醇-乙醇-水（3∶1∶1）作洗脫劑，分出的綠色樣品色素即為葉綠素。

2.3.3 菠菜色素的紫外光譜測(cè)定

胡蘿卜素的紫外光譜測(cè)定：將分離所得橙黃色樣品用石油醚稀釋后加到1 cm的比色皿中，以石油醚做空白試劑，用V-240紫外分光光度計(jì)測(cè)得λmax為480 nm、452 nm，對(duì)應(yīng)的吸光度分別為0.494、0.576。

葉黃素的紫外光譜測(cè)定：將分離所得黃色樣品用石油醚稀釋后加到1 cm的比色皿中，以石油醚做空白試劑，用V-240紫外分光光度計(jì)測(cè)得λmax為447 nm、423 nm，對(duì)應(yīng)的吸光度分別為0.673、0.457。

葉綠素的紫外光譜測(cè)定：將分離所得綠色樣品用石油醚稀釋后加到1 cm的比色皿中，以石油醚做空白試劑，用V-240紫外分光光度計(jì)測(cè)得λmax為662 nm、429 nm，對(duì)應(yīng)的吸光度分別為0.236、0.342。

3 結(jié)論

該研究采用色素提取液和吸附劑氧化鋁混合干燥后的固體加入法進(jìn)行柱層析操作，對(duì)液體添加法進(jìn)行了改良，實(shí)現(xiàn)了色素固體加入的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化研究改革。研究發(fā)現(xiàn)，通過改進(jìn)后胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b在洗脫劑（流動(dòng)相）的作用下先后出現(xiàn)了橙色、黃色、藍(lán)綠色、黃綠色四個(gè)均勻分層、顏色鮮明、完整的色譜帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)期完美結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了菠菜色素的有效分離及提純。實(shí)驗(yàn)色素浸膏的優(yōu)化加入使實(shí)驗(yàn)教學(xué)的現(xiàn)象更加直觀、有效，避免了實(shí)驗(yàn)結(jié)果不清楚、現(xiàn)象不明對(duì)學(xué)生的負(fù)面影響，有利于學(xué)生對(duì)主要色素的極性大小、吸附原理、流動(dòng)相和固定相等知識(shí)概念的生動(dòng)形象理解，方便了理論知識(shí)和實(shí)踐環(huán)節(jié)的銜接，有助于學(xué)生對(duì)技能知識(shí)的掌握，加強(qiáng)了學(xué)生創(chuàng)新思維的培養(yǎng)，大大調(diào)動(dòng)了學(xué)生實(shí)踐操作的積極性和主動(dòng)性。