霍 靜，白京凡，喬 虹，白晉華，郭紅彥

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北方功能油料樹種培育與研發(fā)山西省重點實驗室，山西 太谷 030801)

大果櫸(Zelkovasinica)又名小葉櫸、抱櫸，為榆科櫸屬的一種落葉喬木[1]，是第三世紀(jì)溫帶森林孑遺物種[2]，也是山西省珍惜的鄉(xiāng)土樹種[3]。大果櫸較喜光、喜溫暖濕潤氣候，耐干旱、貧瘠，常生長在石灰?guī)r發(fā)育的山地鈣質(zhì)土壤上，在我國主要分布于甘肅、陜西、四川北部、湖北西北部、河南、山西南部和河北等地[4-5]。在大果櫸的栽培繁育過程中，低溫是限制其生長與分布的主要環(huán)境因素[3]。

低溫作為重要的非生物脅迫因子，對植物生長發(fā)育有重要影響，會造成植物新陳代謝等生理過程的紊亂，使生物膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭受損傷[6-8]。關(guān)于林木抗寒性的研究已有諸多報道，在楊樹、楨楠、梨、核桃等植物[9-12]抗寒性的研究中發(fā)現(xiàn)，植物的抗寒性與相對電導(dǎo)率、MDA和可溶性蛋白含量等指標(biāo)的變化具有一定相關(guān)性。研究表明，噴施外源物質(zhì)能有效影響和控制植物的生長發(fā)育及對低溫脅迫的適應(yīng)性[13]，低溫來臨前施用一定濃度的生長調(diào)節(jié)劑、CaCl2均可提高植物的抗寒性，緩解植物的低溫傷害[14]。PP333是一種高效、低毒的植物生長調(diào)節(jié)劑，能延緩生長、控制形態(tài)建成、提高植物抗性[15-16]；Ca2+不僅是植物生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素,且參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)過程，在細(xì)胞內(nèi)逆境信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物對逆境的調(diào)節(jié)適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[17]。目前，有關(guān)櫸屬植物抗寒性方面的研究引起人們的重視，經(jīng)外源物質(zhì)處理的大果櫸幼苗對低溫的生理響應(yīng)尚未見報道。本研究根據(jù)大果櫸栽培過程中遇到的實際問題，探索不同濃度PP333與CaCl2處理對大果櫸抗寒性的影響，以期為提高大果櫸幼苗抗寒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃中扦插的當(dāng)年生大果櫸盆栽苗。于2018年3月底，選取生長基本一致、無病蟲害、直徑8 mm的大果櫸枝條剪成10 cm的插穗，以每缽一根的標(biāo)準(zhǔn)，分別插于裝有珍珠巖與草炭(比例為1∶1)、規(guī)格為10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽中，日常管理使溫室內(nèi)保持70%的濕度。待生根后將整株幼苗移栽到21 cm×21 cm的營養(yǎng)缽內(nèi)，栽培基質(zhì)為田土和營養(yǎng)土1∶1混合，基質(zhì)約占營養(yǎng)缽體積的80%，每盆1株，置于室外，進(jìn)行常規(guī)的澆水養(yǎng)護(hù)，緩苗至生長健壯后噴施外源物質(zhì)、進(jìn)行低溫脅迫。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選用PP333和CaCl2處理大果櫸幼苗，設(shè)置對照(清水)、PP333(0.1%、0.15%)和CaCl2(20、25 mmol/L)共5個處理。于2018年8月15日早上8：00，將大果櫸盆栽苗分成5組，每個處理20株，進(jìn)行葉面噴施，以葉面滴水為宜，每隔5 d噴1次，共處理3次。

于2018年10月中旬，隨機選取不同處理苗木的1年生枝條，每個處理選6株，每株采3個側(cè)枝，共90個枝條；將采集的枝條用濕報紙包裹帶回實驗室進(jìn)行人工模擬低溫處理，設(shè)置4、-10、-15℃ 3個溫度梯度，各溫度均放不同處理采自不同植株的枝條6個，每個溫度30個枝條，低溫處理12 h。在4℃環(huán)境下解凍，分別取每個處理不同溫度條件下的枝條基部起第4～6位的葉片混勻、用于生理指標(biāo)的測定，每個指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

2018年11月至2019年2月，統(tǒng)計自然越冬過程中不同處理大果櫸枝條的凍害級別，每月1次，共4次。

1.3 指標(biāo)測定

光合色素含量采用乙醇浸提比色法[18]，可溶性蛋白含量按照G-250考馬斯亮藍(lán)法測定[19]，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法測定[20]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定[19]。

參照李瑞雪[21]田間凍害調(diào)查法的標(biāo)準(zhǔn)對冬季不同處理大果櫸扦插苗的凍害等級進(jìn)行統(tǒng)計，并在此基礎(chǔ)上稍有改動，共分為6級，依次為：0級，枝條無受凍現(xiàn)象；1級，枝條受凍比例<20%；2級，枝條受凍比例<40%；3級，枝條受凍<60%；4級，枝條受凍比例<80%；5級，幾乎所有枝條或整株幼苗凍死。

1.4 抗寒性綜合評價方法

參照玉蘇甫·阿不力提甫等[22]的方法，運用相關(guān)性分析和隸屬函數(shù)法對大果櫸的抗寒性進(jìn)行綜合分析。隸屬函數(shù)值的計算方法如下：

如果指標(biāo)與抗寒性為正相關(guān)，Zij=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)

如果指標(biāo)與抗寒性為負(fù)相關(guān)，Zij= 1-(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)

式中，Zij為第i個處理第j個指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值；Xij為第i個處理第j個指標(biāo)的測定值；Ximin和Ximax分別為各指標(biāo)的最小值和最大值；后求出各處理的平均隸屬度進(jìn)行比較。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0、Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，結(jié)合LSD與Duncan法進(jìn)行方差分析與多重比較，各指標(biāo)間采用Spearman系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對低溫脅迫下大果櫸光合色素的影響

不同處理的大果櫸幼苗光合色素含量隨溫度降低均呈現(xiàn)出逐步下降的趨勢；與對照相比，噴施外源物質(zhì)可不同程度減緩低溫脅迫下大果櫸光合色素的降解。在相同溫度條件下，經(jīng)P1、P2、C1、C2處理的大果櫸葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、類胡蘿卜素含量均高于對照；P2處理的大果櫸葉綠素a、葉綠素總量與對照相比差異顯著；C1、C2處理后的4個色素含量均顯著高于對照，且20 mmol/L CaCl2時達(dá)到峰值，處理效果最好。-15℃時，20 mmol/L CaCl2處理的大果櫸幼苗光合色素含量分別比對照高8.15、1.64、9.79、1.36 mg/g(圖1)。

注：不同小寫字母表示相同溫度不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同處理不同溫度間差異顯著(P<0.05)。CK、P1、P2、C1、C2分別表示對照，0.1% PP333，0.15% PP333，20 mmol/L CaCl2，25 mmol/L CaCl2。下同。

2.2 對低溫脅迫下大果櫸可溶性蛋白含量的影響

相同低溫條件下，與對照相比，不同外源物質(zhì)處理均可促進(jìn)大果櫸葉片中可溶性蛋白含量的積累，延緩低溫脅迫下可溶性蛋白含量的減少。PP333處理后的可溶性蛋白含量隨濃度的增加而增加，CaCl2處理的大果櫸葉片中可溶性蛋白含量隨濃度的升高而降低，且CaCl2處理后的可溶性蛋白含量均高于PP333；其中，C1、C2在各溫度下的可溶性蛋白含量均顯著高于對照。不同低溫環(huán)境下，C1處理后的大果櫸幼苗可溶性蛋白含量比對照分別顯著增加7.34、8.59、6.19 mg/g，C2處理后的分別顯著提高5.26、5.19、5.07 mg/g，以20 mmol/L CaCl2促進(jìn)效果最好(圖2)。

圖2 不同處理對低溫脅迫下大果櫸可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on soluble protein content of Z.sinica

2.3 對低溫脅迫下大果櫸相對電導(dǎo)率的影響

研究結(jié)果表明(圖3)，各處理對不同低溫下大果櫸葉片的相對電導(dǎo)率均有顯著影響，與 CK相比，噴施外源物質(zhì)不同程度降低了大果櫸葉片的相對電導(dǎo)率、減小了隨溫度降低各處理大果櫸幼苗相對電導(dǎo)率的上升幅度。在相同溫度條件下，P1、P2處理的大果櫸相對電導(dǎo)率均低于對照、但差異不顯著，C1、C2處理后大果櫸的相對電導(dǎo)率均顯著低于對照。2種外源物質(zhì)分別以P2、C1處理效果較好；C1處理可顯著減緩相對電導(dǎo)率的增加，且對-15℃脅迫后大果櫸幼苗相對電導(dǎo)率的影響最大，與CK相比顯著降低35.75%。

圖3 不同處理對低溫脅迫下大果櫸相對電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of different treatments on relative conductivity of Z.sinica

2.4 對低溫脅迫下大果櫸丙二醛含量的影響

不同低溫環(huán)境下，經(jīng)外源物質(zhì)處理的大果櫸幼苗MDA含量均低于對照，各處理在-10℃時的MDA含量與對照相比均差異顯著，分別降低30.69%，34.38%，60.09%，36.30%。PP333處理的大果櫸MDA含量隨濃度增加而降低，P2處理的MDA含量在-10℃、-15℃時與CK相比差異顯著；經(jīng)C1、C2處理后的大果櫸MDA含量在不同溫度下均顯著低于對照。不同處理大果櫸的MDA含量均隨溫度降低而不斷上升，從-10℃～-15℃，PP333處理與對照組的大果櫸幼苗MDA含量均顯著升高，C1、C2處理的大果櫸MDA含量升高不顯著，且C1處理后的大果櫸MDA含量在不同溫度下均最低、隨溫度降低其上升幅度最小(圖4)。

圖4 不同處理對低溫脅迫下大果櫸丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on MDA content of Z.sinica

2.5 不同處理對大果櫸幼苗越冬過程中凍害程度的影響

在自然越冬過程中，大果櫸幼苗有不同程度的凍害現(xiàn)象。與對照相比(表1)，噴施外源物質(zhì)均可不同程度減緩大果櫸幼苗的受凍害情況。2018年11月，不同處理大果櫸幼苗均沒有發(fā)生凍害現(xiàn)象。2018年12月，部分處理的大果櫸幼苗枝條開始出現(xiàn)凍害，且隨時間推移，受凍害程度不斷加深。到2019年2月，對照組大果櫸幼苗受凍害最嚴(yán)重、凍害級別達(dá)5級；經(jīng)P1和P2處理的大果櫸幼苗凍害級別分別為4級、3級；經(jīng)CaCl2處理的大果櫸幼苗耐寒力較好，噴施20 mmol/L CaCl2的大果櫸受凍害程度最低，凍害級別為1級。

表1 自然越冬過程中各處理大果櫸的凍害級別Table 1 Freezing damage levels of Z.sinica during the natural over wintering process

2.6 大果櫸各抗寒指標(biāo)之間的相關(guān)性

對不同處理大果櫸幼苗各生理指標(biāo)與凍害級別之間的相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，光合色素、可溶性蛋白含量與凍害級別呈極顯著負(fù)相關(guān)，其值越高，凍害程度越低，抗寒性越強；相對電導(dǎo)率、MDA含量與凍害級別呈極顯著正相關(guān)，其值越高，凍害程度越嚴(yán)重，抗寒性越弱。

表2 大果櫸各抗寒指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients among cold resistance indexes of Z.sinica

2.7 不同處理對大果櫸幼苗抗寒性影響的綜合評價

對不同濃度PP333、CaCl2處理大果櫸幼苗的各項生理指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，綜合評價各處理對低溫脅迫下大果櫸抗寒性的影響。外源物質(zhì)對大果櫸抗寒性影響的綜合評價值均高于對照(表3)，低溫下各處理的隸屬函數(shù)值排序依次為C1>C2>P2>P1>CK，與自然越冬后不同處理大果櫸凍害級別所反映出的結(jié)果相一致，以20 mmol/L CaCl2緩解大果櫸低溫傷害的效果最好。

表3 不同處理對大果櫸抗寒性影響的綜合評價Table 3 Comprehensive evaluation of the effects of different treatments on cold resistance of Z.sinica

3 討論

3.1 對低溫脅迫下大果櫸幼苗光合色素的保護(hù)作用

光合作用為植物生長、發(fā)育提供所需的物質(zhì)和能量，是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)。低溫對植物光合色素產(chǎn)生、光系統(tǒng)活性及光合能量代謝等一系列過程都有不同程度的影響[23]。具體表現(xiàn)為，低溫脅迫會抑制光合作用反應(yīng)中酶活性的水平，破壞葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)，引起光合色素降解[24]，導(dǎo)致光合能力下降，進(jìn)而影響植物的其他生理代謝過程[13-14,25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，經(jīng)PP333、CaCl2處理后的大果櫸幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量有所提高，說明適宜濃度的外源PP333和CaCl2對大果櫸葉綠素的結(jié)構(gòu)和功能具有一定的保護(hù)作用，在遭遇低溫脅迫時仍能夠維持其結(jié)構(gòu)與功能、發(fā)揮正常的生理作用，這與于永暢等[26]對國蘭、孫兵等[27]對楨楠和閩楠抗寒性的研究結(jié)果相一致?？赡茉蚴峭庠次镔|(zhì)起到調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的作用，最終減少低溫對葉綠體的破壞，在促進(jìn)光合色素合成的同時，保護(hù)光合色素的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)光合色素的含量維持在一個較高水平。

3.2 對低溫脅迫下大果櫸幼苗的滲透調(diào)節(jié)作用

可溶性蛋白是廣泛存在于植物細(xì)胞液中能夠調(diào)控滲透壓的物質(zhì)之一[28]，在植物細(xì)胞中含量的高低與植物抗寒性之間有著密切的關(guān)系[14]。研究表明，噴施適當(dāng)濃度的外源物質(zhì)可誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生并積累一定量的可溶性蛋白，進(jìn)而增加植物細(xì)胞滲透壓、減緩細(xì)胞內(nèi)水分損失，以增強植株對低溫的抵抗力[14,29]?？扇苄缘鞍缀康纳仙€能降低植物細(xì)胞液的冰點，從而提高植物對低溫的耐受力[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫前用PP333、CaCl2處理后的大果櫸幼苗，其可溶性蛋白含量均顯著升高，說明經(jīng)外源物質(zhì)處理的大果櫸幼苗在低溫脅迫下可通過自身的調(diào)節(jié)能力而自發(fā)產(chǎn)生某種對低溫脅迫的適應(yīng)機制，積累一定的蛋白含量，緩解低溫脅迫帶來的傷害，這與梁永富等[30]關(guān)于生長調(diào)節(jié)劑對低溫脅迫下酸橙影響的研究結(jié)果相一致，且可溶性蛋白含量與大果櫸抗寒性呈正相關(guān)，其含量越高，抗寒性越強。

3.3 對低溫脅迫下大果櫸幼苗細(xì)胞膜的保護(hù)作用

在低溫環(huán)境下，植物敏感和最易傷害的部位是細(xì)胞膜[31]。植物處于逆境時，其體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)致使細(xì)胞膜被破壞、透性增加，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)向胞間滲漏，從而導(dǎo)致植物的電導(dǎo)率增加[13]，嚴(yán)重時還會發(fā)生膜脂過氧化作用。相對電導(dǎo)率是反映細(xì)胞膜透性大小的指標(biāo)，其值越大，說明受脅迫后細(xì)胞膜的透性越大[14,32]；MDA是反映生物膜過氧化程度的指標(biāo)，其含量多少可以體現(xiàn)細(xì)胞膜受傷害的程度[6,32]，MDA含量積累越多，膜系統(tǒng)受傷害越嚴(yán)重，MDA含量與植物抗寒性呈負(fù)相關(guān)性[22,33]，本研究中MDA和相對電導(dǎo)率與大果櫸幼苗凍害級別呈極顯著正相關(guān)的結(jié)果與此相一致。噴施PP333、CaCl2可顯著減緩大果櫸幼苗在低溫脅迫下葉片中MDA含量和相對電導(dǎo)率的上升，且隨溫度降低CaCl2處理的大果櫸幼苗MDA含量升高不顯著，說明經(jīng)CaCl2處理后大果櫸幼苗的細(xì)胞膜系統(tǒng)在低溫脅迫下受害程度較低。總之，葉面噴施外源物質(zhì)可以減少活性氧的產(chǎn)生，降低膜脂過氧化的程度，有效抵御低溫對大果櫸幼苗的傷害，從而提高了大果櫸幼苗的抗寒性，這與王麗特等[24]關(guān)于4種化學(xué)調(diào)控劑對煙草幼苗耐冷性、周偉權(quán)等[34]對庫爾勒香梨抗寒性的研究結(jié)果相類似。

3.4 大果櫸幼苗抗寒性的綜合評價

植物各抗寒性指標(biāo)間有一定的相關(guān)性[22,33,35]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫下大果櫸幼苗的凍害級別與其相對電導(dǎo)率、MDA含量呈極顯著正相關(guān)，與光合色素、可溶性蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；在低溫脅迫下，大果櫸幼苗相對電導(dǎo)率、MDA含量越低，葉綠素、可溶性蛋白含量越高，其受凍害程度越低，抗寒性越強。采用單一指標(biāo)評價植物的抗寒性不具有代表性，應(yīng)采用多個指標(biāo)對其抗寒能力進(jìn)行綜合評價[22,34-35]。本研究運用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)法能較全面地反映不同處理大果櫸幼苗的抗寒性強弱，平均隸屬度越大，表明抗寒能力越強，反之抗寒能力越弱[21-22]。結(jié)合自然越冬后各處理凍害級別和抗寒性綜合評價結(jié)果可知，經(jīng)PP333、CaCl2處理后的大果櫸幼苗在低溫脅迫條件下其抗寒能力均有所提高，以20 mmol/L CaCl2處理的抗寒性效果最好，可為今后大果櫸生產(chǎn)提供可靠的依據(jù)。

4 結(jié)論

低溫是影響大果櫸生長的重要環(huán)境因子之一，在大果櫸栽培過程中應(yīng)采取相應(yīng)抗寒措施降低大果櫸樹苗的低溫傷害，以確保其正常越冬。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫來臨之前，葉面噴施PP333、CaCl2均能夠減緩低溫脅迫下大果櫸幼苗光合色素的下降趨勢，促進(jìn)可溶性蛋白的積累，降低細(xì)胞膜的相對電導(dǎo)率和MDA含量，并最終提高低溫脅迫下大果櫸幼苗的抗寒性。不同處理對大果櫸抗寒性影響的隸屬函數(shù)綜合評價結(jié)果與自然越冬后凍害級別的統(tǒng)計結(jié)果相一致，以20 mmol/L CaCl2處理的大果櫸幼苗抗寒效果最好。