周 潔，王保松

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153)

柳樹為楊柳科柳屬的總稱，全世界520多種，我國(guó)有257種，122變種，33種變型[1]。柳樹分布廣泛,種類繁多，生長(zhǎng)速度快，耐水濕，耐低度鹽堿，造林范圍廣，是集觀賞價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值于一體的多功能樹種[2]。柳樹一般是雌雄異體植物，雖有報(bào)道發(fā)現(xiàn)柳樹存在雌雄同序和兩性花[3],但是雌雄同序三性型柳樹的自交尚未見報(bào)道。

植物表型性狀是物種資源研究最基本的方法和途徑，是資源保護(hù)與評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是育種的重要基礎(chǔ)。關(guān)于園林植物觀賞價(jià)值評(píng)價(jià)方法的研究比較多，大多數(shù)學(xué)者從美學(xué)角度著手，采用百分制法、層次分析法、心理物理學(xué)法、感官評(píng)分法、加權(quán)評(píng)分法、灰色關(guān)聯(lián)分析法和模糊相似優(yōu)先比法等評(píng)價(jià)方法，但由于不同植物的觀賞重點(diǎn)不同，以及評(píng)價(jià)過(guò)程中各種定性與定量指標(biāo)權(quán)重和分值的不確定性，導(dǎo)致暫且未形成公認(rèn)的比較成熟的評(píng)價(jià)方法和評(píng)價(jià)體系[4-9]。

自交是創(chuàng)制優(yōu)異中間材料和種質(zhì)資源的有效方式之一。通過(guò)自交可使一些隱性基因得到表現(xiàn),從而獲得豐富的基因變異及表型差異[10]。本研究通過(guò)自交的方法建立了柳樹的自交F1代，在自交群體中發(fā)現(xiàn)了性狀的分離，出現(xiàn)枝條的變異、葉片的皺縮、植株的矮化、分枝的變化等表型的改變。通過(guò)對(duì)表型，如株高、葉片長(zhǎng)、葉片寬、枝條彎曲程度及比例的描述和評(píng)價(jià)，分析柳樹自交群體的性狀分離程度，為柳樹重要性狀的分離和基因的鑒定奠定重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為雌雄間性柳樹品種‘蘇柳795’(如圖1)自交所獲得的子代群體。于2019年1月中采集‘蘇柳795’花枝進(jìn)行水培，置于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹種質(zhì)資源圃溫室，對(duì)花枝進(jìn)行修剪，去除多余的葉片和花芽，3—4月待開花后進(jìn)行人工雜交。雜交時(shí)為避免花粉互相傳播，利用紗網(wǎng)將花枝包住，待花序完全開放后，采用人工涂抹的方式進(jìn)行雜交。將全雄花序和雌雄同序的雄花花粉給全雌花序和雌雄同序的柱頭授粉，獲得自交種子，收獲種子后播于裝有泥炭的穴盤中，獲得自交苗。待5月苗生長(zhǎng)健壯時(shí)移栽入裝有泥炭珍珠巖混合基質(zhì)的無(wú)紡布袋子中，對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行編號(hào)，以待觀測(cè)。

a.‘蘇柳795’雄花序；b. ‘蘇柳795’雌雄同序；c. ‘蘇柳795’雌花序。圖1 ‘蘇柳795’不同性別花序

1.2 表型性狀的觀測(cè)與統(tǒng)計(jì)

表型性狀的觀測(cè)于雜交當(dāng)年秋季10月待苗木生長(zhǎng)健壯時(shí)統(tǒng)計(jì)。葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)的取樣部位為從頂部開始往下數(shù)第3片完整老熟具有代表性的葉片。株高的測(cè)量為從植株頂部至基質(zhì)表面的高度。于當(dāng)年秋季和次年的春季分別進(jìn)行測(cè)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2010，SPSS 20.0軟件，分別對(duì)各種表型性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳變異度分析。數(shù)量性狀直方圖使用R(V4.0.2版本)軟件中自帶的hist()函數(shù)進(jìn)行作圖。具體參數(shù)說(shuō)明如下：x，輸入數(shù)據(jù)；probability=T繪制樣本頻次；若為F則繪制密度；col設(shè)置直方圖中柱子的顏色，xlab設(shè)置橫軸標(biāo)簽；main設(shè)置圖標(biāo)簽，xfit,設(shè)置橫軸顯示范圍(最小值到最大值)，yfit 根據(jù)x變量生成擬合y值，lines()函數(shù)根據(jù)x和y畫線，lwd設(shè)置線寬。并用R中自帶的ks.test()函數(shù)和shapiro.test()函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀特征

在自交子代群體中，表型性狀枝條、葉片、干型、分枝等都出現(xiàn)了較大的變異。枝條顏色有綠色(b，d)、金色(c)和紅色(a，e)(如圖2)。枝條姿態(tài)有直伸(j)、彎曲(k，n)、扭曲(b，c)、矮化(g)(株高<5 cm)等不同的類型。分枝數(shù)和分枝角度也出現(xiàn)了較大的分離，h—n較為高大，有通直沒(méi)有分枝的類型j，也有分枝數(shù)較多的如i和m；分枝部位不同，有基部分枝f，上部分枝的h和中部分枝的i；分枝角度也出現(xiàn)了較大變化，如i的分枝幾近平展，l和m的分枝角度較窄。

在自交F1代中，葉片的葉形出現(xiàn)了多種類型(見圖3)?！K柳795’為披針形，葉柄綠色，無(wú)托葉。子代中葉形有披針形(231，292)，卵圓形(310，350，140)，長(zhǎng)披針形(242，11，299)，變小(96)，葉柄顏色有紅綠(242，11)和綠色(66)，矮化的葉片沒(méi)有葉柄，部分植株出現(xiàn)了托葉(271)。葉片正面顏色有深綠(242)、淺綠(48)、黃綠(297)。葉片基部形狀‘蘇柳795’為契形，140為圓形，299為窄契形。

2.2 自交子代表型性狀統(tǒng)計(jì)

自交共獲得存活的子代478個(gè)，生長(zhǎng)正常。在植株的表型中，出現(xiàn)了枝條、葉片等的性狀分離。干型有通直、彎曲、扭曲3種類型，經(jīng)統(tǒng)計(jì)其中通直的占10.46%，扭曲的為18.41%，彎曲的為71.13%。葉片寬圓形的占13.81%，披針形的占31.17%，線形的為12.13%，葉片縮小的比例為25.73%，且出現(xiàn)了皺縮的現(xiàn)象。有托葉的占2.3%，矮化的占11.72%(見表1)。

圖2 自交F1代株型變異

注：葉片編號(hào)對(duì)應(yīng)于子代個(gè)體編號(hào)圖3 自交子代葉片性狀特征

表1 自交子代各性狀比例

2.3 數(shù)量性狀變異分析

對(duì)自交子代478個(gè)個(gè)體數(shù)量性狀株高、葉長(zhǎng)、葉寬、托葉等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)年雜交苗秋季最高的株高為120 cm，最矮的為1 cm，平均株高為31.89 cm。雜交后第2年春季對(duì)株高再次測(cè)量，最高株高為205 cm，最矮的為2 cm，平均株高為52.76 cm。葉最長(zhǎng)為15.1 cm，最短為0.2 cm，葉寬最長(zhǎng)為1.7 cm，最小為0.1 cm，葉片長(zhǎng)寬比最大比為15，最小為2；托葉最長(zhǎng)為1.7 cm，最小為0.2 cm，托葉寬為0.1—0.2 cm，托葉長(zhǎng)寬比為0—12。其中變異最大的為株高，當(dāng)年株高變異系數(shù)為66%，第2年株高變異系數(shù)達(dá)77%(見表2)。

表2 柳樹自交子代數(shù)量性狀變異分析

2.4 自交子代數(shù)量性狀頻率分布

在對(duì)478個(gè)自交子代的3個(gè)數(shù)量性狀變異情況統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上，繪制了數(shù)量性狀的分布頻次圖(見圖4)。圖4顯示葉長(zhǎng)、葉寬、株高、葉片長(zhǎng)寬比均未呈現(xiàn)正態(tài)分布，均呈偏態(tài)分布。

注：a—e分別為葉長(zhǎng)、葉寬、葉片長(zhǎng)寬比、當(dāng)年株高、第2年株高分布曲線圖4 數(shù)量性狀分布圖

3 結(jié)論與討論

植物表型性狀的鑒定與描述是研究種質(zhì)資源的最簡(jiǎn)單、易行的基本方法，也是檢測(cè)遺傳變異最傳統(tǒng)、最直觀的方法[11-12]。柳樹在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)方面已進(jìn)行了耐鹽[13]、耐熱[14]、觀賞[15]等方面的評(píng)價(jià)。柳樹作為雌雄異株植物，利用自交子代進(jìn)行數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀的變異分析和評(píng)價(jià)還是首次。種質(zhì)資源的遺傳變異系數(shù)越大，其遺傳多樣性程度越高。自交子代的性狀分離是研究等位基因的重要材料，具有較豐富的遺傳變異，變異系數(shù)達(dá)36%—66%，最高的為株高(達(dá)66%)，說(shuō)明自交子代在株高、葉長(zhǎng)、葉寬等方面存在豐富的遺傳多樣性，是種質(zhì)資源多樣性的重要遺傳基礎(chǔ)，對(duì)柳樹育種生長(zhǎng)迅速、干型好的育種選擇具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

生物的連續(xù)性或間斷性變量大多遵從正態(tài)分布[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，柳樹自交群體中株高、葉長(zhǎng)、葉寬未較好地遵從正態(tài)分布，可見在柳樹的自交試驗(yàn)中，偏態(tài)分布可能也是柳樹表型性狀中重要的分布形式之一。偏態(tài)分布的性狀與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)。本研究中所有子代為同一批雜交子代，栽培環(huán)境一致，來(lái)源一致，所以偏態(tài)分布和環(huán)境因素沒(méi)有一定的關(guān)系。一方面主要和遺傳相關(guān)，自交使基因發(fā)生了純合，導(dǎo)致了植株的矮化，出現(xiàn)了矮化株高<5 cm的植株，當(dāng)年雜交苗株高<10 cm的頻次大大增加，和平均株高相同；另一方面可能是由于人為選擇方向所致[17]，即在喬木柳選育工作中，生長(zhǎng)快、植株高一直是選擇的方向和目標(biāo)，因?yàn)檫@種選擇壓力，使得柳樹自交群體向此特定方向進(jìn)化，相應(yīng)性狀的個(gè)體增加，形成拖尾現(xiàn)象。

喬木柳的自交群體中出現(xiàn)了株高、葉片、托葉、枝條、皮色等重要性狀分離，扭曲的枝條占18.41%，矮化的占11.72%，有托葉的為2.30%。龍爪柳[Salixmatsudanavar.matsudanaf.tortuosa(Vilm.) Rehd.]為旱柳的變種，但是對(duì)于枝條扭曲的成因尚不清楚，在自交群體中，扭曲的占近20%，為枝條扭曲的柳樹提供了另外一種解釋。植株的矮化一般由單一基因控制，水稻中OsDWL1[18]、高粱矮化基因Dw3[19]等多種作物中的矮化基因被鑒定，同時(shí)矮化突變體降低了莖稈的同化作用，能將更多的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到穗部，顯著增加產(chǎn)量。柳樹自交群體中的矮化植株占11.72%，為矮化機(jī)理的研究和矮化基因的鑒定提供了理想的研究材料。皮色、葉片大小、托葉均為數(shù)量性狀，為多基因聯(lián)合調(diào)控。柳樹SxMAX基因能顯著增加分枝數(shù)[20]，而在自交群體中基部分枝的占8%，可以通過(guò)克隆自交材料的SxMAX基因，找到功能區(qū)和突變位點(diǎn)，為基因編輯技術(shù)提供基礎(chǔ)。枝條顏色是林木冬季重要的觀賞性狀。目前在西葫蘆皮色、南瓜果皮等果蔬中已鑒定到控制皮色的基因[21-22]，但林木枝條顏色的基因還未見報(bào)道。在自交子代中，出現(xiàn)了皮色金色、紅色、紫色、綠色等的分離，可為枝條顏色的變異規(guī)律和基因克隆提供重要的基礎(chǔ)。

柳樹觀賞性狀的評(píng)價(jià)在于枝條的顏色、枝條的形態(tài)，直立和扭曲枝條的性狀分離是觀賞柳樹新的研究性狀特性，所以矮化、皮色等性狀的鑒定和分枝數(shù)、托葉、葉片長(zhǎng)、葉片寬、株高等數(shù)量性狀的鑒定有利于為柳樹重要基因的鑒定提供理論基礎(chǔ)，自交材料的建立和性狀的評(píng)價(jià)為今后培育柳樹高生物量、枝條顏色艷麗、形態(tài)各異的柳樹提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。