李應(yīng)鶴，初曉紅，宋揚(yáng)，徐剛，李贄，于鐳

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒（PPV）引起的一種豬繁殖障礙病，主要表現(xiàn)為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產(chǎn)母豬產(chǎn)死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母豬本身無明顯的癥狀[1]。豬細(xì)小病毒病目前尚無有效治療方法，主要采取預(yù)防措施，因此豬細(xì)小病毒病疫苗的生產(chǎn)工藝研究尤為重要[2]。本研究分別使用MontanideTMISA 206 VG佐劑（簡稱206佐劑）和白油佐劑進(jìn)行豬細(xì)小病毒病滅活疫苗的配制，首先比較白油佐劑和206佐劑之間乳化工藝差異，再通過疫苗的物理性狀檢測、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，分析兩種佐劑對(duì)疫苗免疫效果的影響[3]。

1 材料

1.1 制苗用病毒液

濃縮后的豬細(xì)小病毒L株滅活病毒液（濃縮前病毒液紅細(xì)胞凝集價(jià)為1∶512），由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備和提供。

1.2 主要試劑

MontanideTMISA 206 VG佐劑（206佐劑），購自法國賽比克公司；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA），購自Sigma公司；Span-80和Tween-80，購自廣州西隴化工有限公司；硬脂酸鋁，購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 紅細(xì)胞凝集抑制抗原

豬細(xì)小病毒L株，批號(hào)為PPV-HI Ag-201401，紅細(xì)胞凝集價(jià)為1∶512，規(guī)格為1.0 mL·瓶-1，均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備或提供。

1.4 血清

豬細(xì)小病毒陽性血清，批號(hào)為PPV-Pos-Serum-201401，HI效價(jià)為1∶512，規(guī)格為1.0 mL·支-1；豬細(xì)小病毒陰性血清，批號(hào)為PPV-Neg-Serum-201401，規(guī)格為1.0 mL·支-1，均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備或保存。

1.5 紅細(xì)胞懸液

0.5%豚鼠紅細(xì)胞懸液按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行制備。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物

2～4日齡乳鼠，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；1.5～2月齡的仔豬和5～6月齡的初產(chǎn)母豬（豬瘟中和抗體陰性、豬細(xì)小病毒HI抗體效價(jià)不超過1∶8），購自黑龍江省哈爾濱市郊某豬場，品種為長白。

2 方法

2.1 MontanideTM ISA 206 VG佐劑疫苗配制

2.1.1 油相制備

將206佐劑置于油相制備罐中，加熱至30℃，備用。

2.1.2 水相制備

使用檢驗(yàn)合格的豬細(xì)小病毒滅活液作為水相，同時(shí)采用ST-S無血清培養(yǎng)液作為對(duì)照組水相。

2.1.3 乳化

將油相與水相按體積比為1∶1混合，真空或正壓加料并循環(huán)攪拌至油相與水相充分混合，乳化成雙相油乳劑。疫苗制備情況見表1。

表1 206佐劑1 000頭份疫苗配制 mL

2.1.4 分裝

無菌定量分裝，加蓋密封，粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存，備用。

2.2 白油佐劑疫苗的配制

2.2.1 油相制備

取注射用白油94份，加入硬脂酸鋁1.5份，邊加熱邊攪拌，直至完全透明，再加入4.5份Span-80，充分混勻，116℃高壓滅菌30 min后備用。

2.2.2 水相制備

取檢驗(yàn)合格的豬細(xì)小病毒滅活液，混合抗原96份，加入4份滅菌Tween-80，待Tween-80完全溶解，制備成白油佐劑疫苗所需的水相；取配制好的ST-S無血清培養(yǎng)液96份，加入4份滅菌Tween-80，待Tween-80完全溶解制備成對(duì)照組水相。

2.2.3 乳化

水相和油相按體積比1∶1.5混合，先將油相注入預(yù)混罐中，2 500 r·min-1攪拌，緩慢加入水相，再注入乳化罐，以10 000 r·min-1乳化5～8 min，使混合物充分乳化。疫苗制備情況見表2。

表2 白油佐劑1 000頭份疫苗配制所需成分制備mL

2.2.4 分裝

無菌定量分裝，加蓋密封，粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存，備用。

2.3 疫苗檢驗(yàn)

2.3.1 性狀檢驗(yàn)

按《中國獸藥典》附錄對(duì)206佐劑疫苗和白油佐劑疫苗的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.3.2 無菌檢驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄對(duì)206佐劑疫苗和白油佐劑疫苗進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

2.3.3 安全檢驗(yàn)

用乳鼠檢驗(yàn)：將2～4日齡乳鼠20只按表3隨機(jī)分為4組，每組5只，每只皮下注射疫苗0.1 mL，觀察7 d。

用豬檢驗(yàn)：將斷奶后1.5～2月齡豬8頭按表3隨機(jī)分為4組，每組2頭，深部肌肉注射疫苗5 mL，觀察21 d。

表3 不同佐劑疫苗與對(duì)照分組

2.3.4 效力檢驗(yàn)及免疫期測定

將5～6月齡的初產(chǎn)母豬20頭按表3分為4組，每組5頭，第1組和第2組經(jīng)頸部肌肉途徑接種疫苗2.0 mL，第3組和第4組經(jīng)頸部肌肉途徑接種疫苗2.5 mL，另設(shè)對(duì)照豬5頭，經(jīng)頸部肌肉途徑注射生理鹽水2.0 mL。

各試驗(yàn)組初產(chǎn)母豬分別在免疫后第0、7、14、21、28、60、90、120、150、180、210天和240天對(duì)所有試驗(yàn)豬采血，分離血清，并測定豬細(xì)小病毒HI抗體效價(jià)。計(jì)算豬細(xì)小病毒HI抗體幾何平均效價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 疫苗性狀檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)制備的4種疫苗進(jìn)行性狀比較，結(jié)果顯示4種疫苗外觀及穩(wěn)定性一致，但采用206佐劑乳化工藝制備的疫苗與白油佐劑制備疫苗的黏度差異顯著。結(jié)果見表4。

表4 疫苗性狀檢驗(yàn)結(jié)果

3.2 兩種乳化工藝流程比較結(jié)果

206佐劑與白油佐劑兩種乳化工藝流程比較，可以看出，豬細(xì)小病毒病滅活疫苗（L株，懸浮培養(yǎng)）在車間生產(chǎn)的情況下，配苗乳化采用206佐劑工藝相對(duì)簡單。結(jié)果見表5。

表5 乳化工藝流程比較結(jié)果

3.3 無菌檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)接種T.G、G.A和G.P培養(yǎng)基檢驗(yàn)，4種疫苗均無細(xì)菌、霉菌污染。

3.4 安全性試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 乳鼠安全性檢驗(yàn)結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室制備的這4種疫苗（見表3），分別按0.1 mL·只-1頸部皮下注射3日齡同窩乳鼠5只，觀察7 d。結(jié)果顯示，分別用4種疫苗接種乳鼠后，在觀察期內(nèi)接種乳鼠全部健活，且無局部和全身不良反應(yīng)。

3.4.2 豬安全性檢驗(yàn)結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室制備的這4種疫苗（見表3），分別經(jīng)深部肌肉注射疫苗5 mL·頭-1，接種1.5～2月齡的豬2頭，觀察21 d。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)室制備這4種疫苗注射豬后，在觀察期內(nèi)接種豬全部健活，且無局部和全身不良反應(yīng)。

3.5 效力檢驗(yàn)及疫苗免疫期測定結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室制備的這4種疫苗（見表3），各經(jīng)頸部肌肉免疫5月齡的初產(chǎn)母豬，每組5頭。免疫后第7天分別測定豬細(xì)小病毒HI抗體效價(jià)，計(jì)算免疫HI抗體幾何平均效價(jià)，進(jìn)行疫苗效力評(píng)估，并進(jìn)行疫苗免疫期測定。

免疫后第7天，第1組（見表3）免疫豬產(chǎn)生HI抗體顯著高于第3組；免疫后第60天，第1組免疫豬HI抗體達(dá)到峰值。第1組免疫6個(gè)月后的HI效價(jià)仍大于規(guī)程要求的1∶64，可以滿足豬生長期免疫保護(hù)的需要。

4 結(jié)論

使用MontanideTMISA 206 VG佐劑制備疫苗，乳化工藝相對(duì)簡單；制備疫苗劑型為水包油包水型，黏度低，易注射，吸收良好；局部和全身均無不良反應(yīng)，安全性良好；免疫后第7天豬細(xì)小病毒206佐劑疫苗免疫豬產(chǎn)生HI抗體顯著高于白油佐劑疫苗，抗體效價(jià)高；免疫期為6個(gè)月，可以滿足免疫保護(hù)期要求，因此確定MontanideTMISA 206 VG佐劑作為豬細(xì)小病毒病滅活疫苗的佐劑。