劉璇，李文亮

(昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650000)

0 引言

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，是全球發(fā)病率第3、死亡率第2的惡性腫瘤[1]。結(jié)直腸癌的預(yù)后與診斷分期緊密相關(guān)，Ⅰ期結(jié)直腸癌的5年相對生存率為90%，而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Ⅳ期結(jié)直腸癌5年相對生存率僅為14%[2]。然而，目前對于結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移并無明確的預(yù)測指標(biāo)。中性粒細(xì)胞作為人體抵抗感染的第一道防線，對各種炎癥信號做出反應(yīng)，對癌癥細(xì)胞亦是如此[3]。然而在腫瘤微環(huán)境中，中性粒細(xì)胞出現(xiàn)一群對腫瘤生長轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用的細(xì)胞，稱為腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TANs）[4]，TANs在腫瘤微環(huán)境中對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[5]。在胃癌中，TANs通過GM-CSF-PD-L1途徑，抑制T細(xì)胞的增殖和功能，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6]。然而在結(jié)腸癌中，TANs的存在及意義尚未可知。基于此，本實(shí)驗采用免疫組化法對54例結(jié)腸癌標(biāo)本中的CD66b進(jìn)行檢測，探究結(jié)腸癌中CD66b與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步分析其與結(jié)腸癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019年7月至2020年6月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科進(jìn)行手術(shù)的患者結(jié)腸組織。每例標(biāo)本均包含結(jié)腸癌旁組織、結(jié)腸癌組織，所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)均依照TNM分期(UICC/AJCC TNM分期系統(tǒng)（2017 年第 8 版）)結(jié)腸癌分類，患者共54例，年齡≤63歲30例，年齡>63歲24例；男30例，女24例；分化程度: 高中分化46例，低分化8例；其中TNMⅠ期 8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例；Ⅳ期4例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 14例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者3例。納入標(biāo)準(zhǔn): 病理檢查確診為結(jié)直腸癌; 患者術(shù)前均未行放療、化療、靶向治療；患者臨床資料完整?；颊咴敢鈪⒓颖狙芯?。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn): 結(jié)直腸 癌晚期出現(xiàn)心、肝、腎等多器官損傷; 過敏體質(zhì)、皮膚易出血; 伴急性腸梗阻、穿孔等并發(fā)癥;臨床資料缺乏; 妊娠或哺乳期婦女及女性育齡患者。

1.2 主要試劑

兔抗人CD66b單克隆抗體，通用型二步法檢測試劑盒（小鼠/兔）（北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋），檸檬酸鹽修復(fù)液（北京中杉金橋），PBS緩沖液（自配制）。

1.3 方法

標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，制作成石蠟標(biāo)本后連續(xù) 2~3μm厚切片。63℃過夜烤片，脫蠟、透明，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃過夜孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精染色，脫水透明后，鏡下觀察。免疫組化染色采用SP法，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判讀

TANs密度：CD66b陽性為可見單個細(xì)胞強(qiáng)染色，主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。計數(shù)5個高倍鏡視野（×400）結(jié)腸癌組織中浸潤的中性粒細(xì)胞數(shù)，排除壞死組織、間質(zhì)組織中染色陽性細(xì)胞，及非特異性染色。以所有病例中TANs密度的平均數(shù)，作為區(qū)分高、低密度腫瘤TANs的指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。樣本率之間比較采用卡方檢驗和Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中TANs的浸潤情況

在結(jié)腸癌旁組織中，CD66b陽性的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞密度低（圖1）；在結(jié)腸癌組織中，可見CD66b陽性的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的大量浸潤（圖2）。

圖1 TANs在結(jié)腸癌旁組織的密度低

圖2 TANs在結(jié)腸癌組織的密度高

2.2 CD66b陽性的TANs在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

CD66b陽性的TANs在結(jié)腸癌中高密度率為：63.0%（34/54），在癌旁組織中高密度率為：18.5%（10/54）, 兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.222，P<0.05），結(jié)腸癌組織內(nèi)CD66b陽性的TANs密度明顯高于癌旁組織（見表1）。

表1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織內(nèi)CD66b的表達(dá)

2.3 結(jié)腸癌組織內(nèi)CD66b陽性的TANs與臨床病理特征的關(guān)系

比較54例結(jié)腸癌組織內(nèi)CD66b陽性的TANs與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD66b陽性的TANs高密度率在浸潤深度 T1-T2、T3-T4中分別為：0%（0/8）、72%（33/46），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；CD66b陽性的TANs在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中高密度率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.015P=0.005）；CD66b陽性的 TANs在TNM分期Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ的高密度率分別為：49%（19/39）、93%（14/15），差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（χ2=9.074，P=0.003）。CD66b陽性的TANs的浸潤密度與TNM分期、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；而與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05）（見表2）。

表2 TANs密度與結(jié)腸癌各臨床參數(shù)的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著人們飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率正在逐年上升，盡管手術(shù)技術(shù)、化學(xué)藥物和分子靶向藥物抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[7]，但至少有三分之一的結(jié)直腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[8]，所以更重要的是阻斷轉(zhuǎn)移，明確其轉(zhuǎn)移和新生血管生成機(jī)制，在其通路的相關(guān)位點(diǎn)或靶點(diǎn)的阻斷尤為重要。

結(jié)腸癌免疫微環(huán)境越來越得到重視，免疫微環(huán)境的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的作用也被人證實(shí)，但是對于TANs的研究仍較少，有研究表明，外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)的增加（即中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率（NLR））已顯示與胰腺癌、胃癌和乳腺癌的不良臨床結(jié)果有關(guān)[9-11]。李等回顧性分析了一組354名患有Ⅰ-Ⅲ期癌癥的CRC患者，并揭示了NLR動態(tài)變化與總體生存之間的密切關(guān)系[12]；高NLR也被證實(shí)可預(yù)測肝切除術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的預(yù)后不良[13]；Dell’Aquila等研究表明，對于接受貝伐單抗加化療的不能切除的轉(zhuǎn)移性CRC患者，高NLR也是一個不良的預(yù)后因素[14]；NLR因其檢測容易，可以作為預(yù)后指標(biāo)。CD66b僅在中性粒細(xì)胞上表達(dá)，在外周血中，CD66b可作為中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物。在許多癌癥中，CD66b陽性的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[15]，因此腫瘤組織中CD66b陽性中性粒細(xì)胞可以作為觀察TANs的標(biāo)記。

浸潤結(jié)直腸癌組織的TANs在腫瘤微環(huán)境中起著重要作用，通過表達(dá)精氨酸酶，MMP-9，VEGF和許多趨化因子（包括CCL2，CCL5和CXCL4）來支持腫瘤擴(kuò)張[16]。一些研究表明中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）可能參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，NETs可以激活CRC細(xì)胞上的toll樣受體9，然后通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移和侵襲[17]。在本組實(shí)驗中，我們通過石蠟切片和免疫組化染色，通過計算其密度，發(fā)現(xiàn)CD66b陽性的TANs的浸潤密度與TNM分期、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。證實(shí)結(jié)腸癌患者伴隨著CD66b的高表達(dá)與患者的病理特征密切相關(guān)，提示CD66b陽性的TANs在乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)中起重要作用。而TANs在結(jié)腸癌的促進(jìn)腫瘤作用是通過TANs的旁分泌還是NETs作用于腫瘤細(xì)胞，將成為本組實(shí)驗后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，結(jié)腸癌中存在大量的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的浸潤，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)。檢測CD66b陽性TANs的密度有成為預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的潛在指標(biāo)。