劉天竹 ，李成森 ，劉博琳 ，李 虹 ，周春玲 △

（1. 遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心·遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院，遼寧 沈陽 110000； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000）

寒熱痹顆粒由桂枝、防風(fēng)、知母、白芍、麻黃、附子、白術(shù)、干姜、地龍、甘草組方，具有散寒清熱、和營定痛功效，用于肌肉關(guān)節(jié)疼痛，局部觸之發(fā)熱，自覺怕冷畏寒，或雖觸之不熱但自覺發(fā)熱，全身熱象不顯，以及風(fēng)濕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎見上述證候者?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn) WS3－B－3104－98 收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十六冊）》，無含量測定項(xiàng)［1］。方中，桂枝發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽化氣，平?jīng)_降氣［2］288；防風(fēng)祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙［2］156；知母清熱瀉火，滋陰潤燥［2］222；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽［2］108。為更全面地控制寒熱痹顆粒的質(zhì)量，參考文獻(xiàn)［3－5］，分別選取上述4 味藥材中相關(guān)活性成分進(jìn)行含量測定，建立了可同時測定寒熱痹顆粒中芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸和芍藥苷5種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC －2010A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有四元泵；Auto science 10200AD 型超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為280 W，頻率為40 kHz）；TU－1950 型分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；Sartorius BSA 224S－CW 型電子天平（精度為萬分之一），Sartorius CP225D 型電子天平（精度為十萬分之一），均購于德國賽多利斯公司。

1.2 試藥

芒果苷對照品（批號為111607－201503，純度為98.4%），升麻素苷對照品（批號為 111522 －201511，純度為94.8%），5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品（批號為 111523－201610，純度為 96.1%），肉桂酸對照品（批號為110786－201604，純度為98.8%），芍藥苷對照品（批號為 110736－201943，純度為 95.1%），均購于中國食品藥品檢定研究院；寒熱痹顆粒（遼寧上藥好護(hù)士藥業(yè)＜集團(tuán)＞有限公司，規(guī)格為每袋10 g，批號分別為20191101，20190302，20190903，20190602，20181005，20180701，201803030，20171203，20171202，20171001）；乙腈（美國天地有限公司），磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為T20090710），均為色譜純；水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18柱（250 mm ×46 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－ 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（程序見表 1）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制備

取芒果苷對照品、升麻素苷對照品、5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品、肉桂酸對照品、芍藥苷對照品各適量，精密稱定，加入70%甲醇，分別制成每1 mL 含芒果苷 101.9 μg、升麻素苷 193.2 μg、5 － O － 甲基維斯阿米醇苷 191.2 μg、肉桂酸 197.6 μg、芍藥苷 1.977 mg 的混合對照品貯備液，以及每1 mL 含芒果苷10.19 μg、升麻素苷 19.32 μg、5 － O－甲基維斯阿米醇苷 19.12 μg、肉桂酸 19.76 μg、芍藥苷 0.197 7 mg 的混合對照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下樣品適量，混勻，研細(xì)，取樣品粉末5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為280 W，頻率為45 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得供試品溶液。分別按處方比例和制備工藝制備不含知母、白芍、防風(fēng)、桂枝的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取上述混合對照品溶液、供試品溶液和4 種陰性對照品溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)按肉桂酸峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)，且各陰性對照均無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.mangiferin 2.paeoniflorin 3.cimicifugin 4.5 － O － methylvisamminoside 5.cinnamic acidA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Paeonia lactiflora D.Negative reference solution lacking Cinnamomum cassia E.Negative reference solution lacking Anemarrhena asphodeloides F.Negative reference solution lacking Saposhnikovia divaricateFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液各5 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。詳見表2。

表2 各成分線性關(guān)系考察及檢測限與定量限測定結(jié)果（n ＝6）Tab.2 Results of linear relation test，LOD and LOQ of each components（n ＝ 6）

檢測限與定量限確定：精密吸取混合對照品溶液5.0 mL，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，作為檢測限測定所用對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液20.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加 70%甲醇，作為定量限測定所用對照品溶液。按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果見表3，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20190602）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于配制后0，4，8，12，16，24 h 時按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表 3，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20190602）適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3，表明方法重復(fù)性良好。

表3 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.3 Results of the precision，stability and repeatability tests（n ＝6）

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號為20190602）2.5 g，共 6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別精密加入對照品溶液（芒果苷0.203 7 mg／mL、升麻素苷 0.772 8 mg ／ mL、5 － O － 甲基維斯阿米醇苷 0.478 0 mg／mL、肉桂酸 0.592 8 mg／mL、芍藥苷5.931 9 mg／mL）各 1 mL，蒸干，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.4 Results of the recovery test of each component（n ＝ 6）

2.4 樣品含量測定

取10 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定3 次，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸和芍藥苷的含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（mg，n ＝3）Tab.5 Content determination of five components in the samples（mg，n ＝ 3）

3 討論

取芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸和芍藥苷對照品，分別加甲醇溶解，分別于200 ～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，5 種成分的最大吸收波長分別為 258，254，254，285，230 nm。升麻素苷和 5 － O－甲基維斯阿米醇苷的最大吸收波長均為254 nm，且其他成分在該波長處均有較好吸收，故選擇254 nm 為測定波長。

按擬訂色譜條件，考察了不同品牌色譜柱［Shiseido Capcell PAK C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和 Aglient SB C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）］對含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，各種不同品牌色譜柱均可使樣品有效分離，各種成分的理論板數(shù)、分離度、對稱因子等均符合要求。

考察了不同流動相及其比例（甲醇－0.1%磷酸水溶液和乙腈－0.1%磷酸水溶液）下色譜峰出峰順序的不同，根據(jù)各成分的分離情況，最終選定乙腈－0.1%磷酸水溶液為測定用流動相。不同品牌的色譜柱和不同流動相組成，色譜峰均能有效分離，表明方法耐用性良好。

綜上所述，本研究中建立的方法簡便、可靠，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于同時測定寒熱痹顆粒中芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸和芍藥苷5 種成分的含量，可供產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。