吳遠波，吳克勤，劉宇政，王 偉，吳 靚，張 鴻

（江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西 南昌 330006）

和肝利膽顆粒是由金錢草、茵陳、枳殼（炒）、黃芩等8 味中藥制成的顆粒劑，具有清熱利濕、舒肝理氣功效，用于治療急性黃疸型肝炎、慢性肝炎活動期、急慢性膽囊炎［1］，是治療肝膽病的常用藥［2］。現(xiàn)行標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第七冊）》［1］，但僅有化學(xué)鑒別項，無含量測定項，質(zhì)量控制水平低，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。枳殼、黃芩為方中主藥，枳殼的有效成分為柚皮苷、新橙皮苷［3］246，黃芩的有效成分為黃芩苷［3］301，均為黃酮類成分，且含量較高，均為藥材的質(zhì)控指標。參考文獻［4 －6］，柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷可在同一條件下被檢識。已有對黃芩中的黃芩苷［7］，對梔子、黃芩中的梔子苷和黃芩苷［2］，以及對和肝利膽糖漿中柚皮苷［8］含量測定的報道，但尚未見同時檢測枳殼、黃芩中多種黃酮類成分的研究。本研究中建立了同時測定和肝利膽顆粒中柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷3 種黃酮類成分含量的高效液相色譜法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Scientific UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國 Thermo Fisher 公司），配有四元梯度泵、WPS－3000SL 型自動進樣器、TCC－3000RS 型柱溫箱、DAD－3000 型檢測器；EX125ZH 型電子天平（精度為十萬分之一），F(xiàn)R124CN 型電子天平（精度為萬分之一），均購自奧豪斯儀器有限公司；KQ－500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500W，頻率為40kHz）；DK－98－ⅡA 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（批號為110722－201815，含量為91.7%，中國食品藥品檢定研究院）；新橙皮苷對照品（批號為wkq20020402，含量為99.0%），黃芩苷對照品（批號為wkq20010908，含量為98.7%），均購自四川省維克奇生物科技有限公司；和肝利膽顆粒（企業(yè)A，批號分 別 為 181032，190345，200215；企 業(yè) B，批 號 為9H010972057；企業(yè) C，批號分別為 190201，191201）；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0.2% 磷酸溶液（20 ∶80，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：283 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜中，柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按柚皮苷峰計不低于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.naringin 2.neohesperidin 3.baicalinA.Mixed reference solution B. Test solution C.Negative reference solution lacking Fructus aurantii D. Negative reference solution lacking Scutellaria baicalensisFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

分別取柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品、黃芩苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成含柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷質(zhì)量濃度分別為 399.81，399.44，497.89 μg ／mL 的對照品貯備液。分別精密量取上述貯備液各適量，置同一容量瓶中，加甲醇稀釋，制成含柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷質(zhì)量濃度分別為 39.98，39.94，99.58 μg／mL 的混合對照品溶液。取樣品，研細，取 2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按樣品處方比例制備不含枳殼和黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備缺枳殼和黃芩的陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取 2.2 項下 3 種溶液各 10 μL，按2.1 項下色譜條件注入液相色譜儀測定，并記錄色譜圖。結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷均能與其他雜質(zhì)峰基線分離，陰性樣品溶液對測定結(jié)果均無干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液 1，3，5，8，10，20 μL，按2.1 項下色譜條件注入液相色譜儀測定，以峰面積（Y）為縱坐標、對照品進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y柚＝26.089 0 X柚＋0.479 4（r ＝ 0.999 5，n ＝ 6），Y新＝ 29.019 0 X新＋ 0.379 0（r ＝0.999 5，n ＝6），Y黃＝52.109 0X黃－0.399 4（r ＝0.999 8，n ＝6）。結(jié)果表明，柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的進樣量分別在 0.039 98 ～0.799 60 μg，0.039 94 ～ 0.798 80 μg，0.099 58 ～1.991 60 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷峰面積的 RSD 分別為0.15%，0.15%，0.14%（n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為9H010972057）樣品，按2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，分別計算含量。結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的平均含量分別為0.855，0.793，2.942 mg／g，RSD 分別為 1.02% ，0.78%，0.60%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時按 2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算 RSD。結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷峰面積的 RSD 分別為 0.78% ，0.82%，0.66% （n ＝ 6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取同一批（批號為9H010972057）已知含量樣品適量，研細，平行取6 份，每份1 g，精密稱定，分別精密加入柚皮苷對照品貯備液、新橙皮苷對照品貯備液各 2 mL，黃芩苷對照品貯備液 6 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，進樣測定，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery tests（n ＝ 6）

耐用性試驗：考察了不同品牌色譜柱（Agilent Zorbax SB C18柱、Capcell Pak C18柱、Thermo Scientific Syncronis C18柱）對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果供試品溶液在3 種色譜柱上均能得到較好分離；考察了不同柱溫（20，25，30 ℃）對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果柱溫對色譜行為有較大影響，柱溫在20 ℃時分離效果最佳；考察了不同比例流動相乙腈 － 0.2% 磷酸溶液（18 ∶82，20 ∶80，22 ∶82，25 ∶75，30 ∶70，V ／ V）對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果使用前 3 種比例的流動相均能達到分離要求，使用后2 種比例的流動相時柚皮苷峰與雜質(zhì)峰無法有效分離，故最終選擇乙腈－0.2%磷酸溶液（20 ∶80，V ／ V）作為流動相。

2.4 樣品含量測定

取 6 批樣品適量，研細，取 2 g，精密稱定，按 2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果見表2。

表2 每袋和肝利膽顆粒樣品含量測定結(jié)果（mg）Tab.2 Content determination of three flavonoids in each bag of Hegan Lidan Granules（mg）

3 討論

3.1 波長選擇

采用二極管陣列檢測器在190 ～400 nm 波長范圍檢測［9－10］，結(jié)果最大吸收波長柚皮苷和新橙皮苷均為283 nm，黃芩苷為277 nm。樣品中柚皮苷、新橙皮苷的含量相對較低，為了提高柚皮苷、新橙皮苷的檢測靈敏度，故檢測波長選擇283 nm。在此波長下，3 種黃酮類成分的色譜峰形均較好，檢測靈敏度均能達到檢測要求，且無其他雜質(zhì)峰干擾。

3.2 提取條件選擇

選擇超聲提取60 min，對不同提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）進行考察，以樣品中柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的綜合提取率為指標，結(jié)果以70%甲醇為提取溶劑時，3 種成分的提取效果最佳。對不同提取方式（超聲處理和加熱回流提?。┖筒煌崛r間（15，30，45，60 min）進行考察，最終確定提取條件為70%甲醇超聲提取30 min。

3.3 流動相選擇

比較甲醇－磷酸溶液和乙腈－磷酸溶液下柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的峰形和分離效果，結(jié)果以乙腈－0.2% 磷酸溶液（20 ∶80，V ／ V）為流動相時，樣品中 3 種成分均能有效分離，且峰形較好，符合方法學(xué)要求。

3.4 方法評價

試驗中測得各企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品中3 種黃酮類成分含量差異較大，這可能與投料時藥材的質(zhì)量及生產(chǎn)工藝的質(zhì)量控制有關(guān)，故控制該3 種黃酮類成分的含量對于保證產(chǎn)品的質(zhì)量有積極意義。本研究中建立的方法操作簡便，結(jié)果準確，重復(fù)性好，可用于同時測定樣品中柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的含量。