王亦磊 ，穆慶麗 ，曹雅靜 ，郭 冬 △

（1. 陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000； 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003； 3. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003）

淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim. 為小堿科多年生直立草本植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿或朝鮮淫羊藿的地上部分［1］，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕功效［2］。藥理學(xué)研究表明，淫羊藿治療陽痿、遺精、骨質(zhì)疏松、手足麻木拘攣療效較好［3］。淫羊藿含有淫羊藿總黃酮、苷類、多糖類及生物堿等化學(xué)成分［4－5］，目前已分離得到多種成分，主要為異戊烯基黃酮類成分，主要成分是8－異戊烯基黃酮及其苷類。淫羊藿苷為特征成分，具有抵抗神經(jīng)元損傷、改善骨代謝、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性［6－7］。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是指以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，選擇道地藥材，依據(jù)現(xiàn)代提取方法，經(jīng)過加工炮制后成為合格飲片，再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備成水煎劑［8－10］。嚴(yán)格遵循傳統(tǒng)湯劑的煎煮原則及操作流程，以保證質(zhì)量穩(wěn)定，工藝統(tǒng)一，以確保用藥劑量準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)湯劑是衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑是否一致的重要參考指標(biāo)［11－12］。指紋圖譜專屬性強(qiáng)，可發(fā)現(xiàn)從原藥材到中藥配方顆粒化學(xué)成分的變化，已成為掌握中藥配方顆粒質(zhì)量變化的關(guān)鍵技術(shù)［13－17］。本研究中選取產(chǎn)自陜西、甘肅、山西、遼寧、東北的15 批淫羊藿飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以淫羊藿苷為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法測定含量，計算出膏率及轉(zhuǎn)移率，并進(jìn)行指紋圖譜研究，為淫羊藿標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂及配方顆粒的制備提供科學(xué)數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ－500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 500 W，頻率為 40 kHz）；BT25S 型天平（精度為十萬分之一），BS210S 型電子天平（精度為萬分之一），均購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ZF－C 型三用紫外分析儀（上海康禾光電儀器有限公司）；HH－S4 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；EH20B 型電熱板（德國 Labtech 公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（批號為120909 －200410，純度≥98.0%），淫羊藿對照藥材（批號為 120918－200809），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸、乙醚、乙酸、乙酯乙醚、乙醇、丁酮均為分析純，水為超純水；淫羊藿藥材信息見表1。硅膠G 薄層板、硅膠H 薄層板、硅膠GF254薄層板均購自青島海洋化工廠。

表1 15 批淫羊藿藥材信息Tab.1 Information of 15 batches of Epimedium brevicornum

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

取15 批淫羊藿飲片各100 g，精密稱定，加入12 倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取30 min，趁熱過濾（200目篩），分離出煎煮液，藥渣再加入12 倍量水，回流提取30 min，趁熱過濾（200 目篩），合并濾液，定容至 2 500 mL，備用。剩余部分減壓濃縮成質(zhì)量濃度為0.2 g／mL 的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，備用，將標(biāo)準(zhǔn)湯劑冷凍干燥，留樣。

2.2 淫羊藿苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 水（28 ∶72，V ／ V）；流速：0.8 mL ／ min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計不低于1 500。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.icariinA. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含無水淫羊藿苷1.354 mg 的溶液，即得對照品貯備液。再取對照品貯備液0.8mL，置10mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL 含無水淫羊藿苷108.32 μg的溶液。分別精密量取15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑各10 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按2.2 項下方法，加水制得不含淫羊藿的陰性對照樣品，再按供試品溶液制備方法制備不含淫羊藿苷的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL 含無水淫羊藿苷2.708，4.333，5.416，27.080，54.160，81.240，108.320，135.400，162.480 μg 的溶液，作為對照品溶液。按 2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得淫羊藿苷線性回歸方程為 Y ＝22.438 4 X －13.855 4，R2＝0.999 8（n ＝9）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在 2.708 ～162.480 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一批（批號為20180901）樣品，依法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣10 μL 測定。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的 RSD 為 2.30%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20180901）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，16，24 h 時進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的 RSD 為 3.46% （n ＝ 7），表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20180901）樣品，依法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的 RSD 為 5.01%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20180901），依法制備供試品溶液，取供試品溶液1 mL，共9 份，分別置5 mL 容量瓶中，精密加入淫羊藿苷對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為 108.32，135.40，162.48 μg ／mL）1 mL，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 淫羊藿苷加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test of icariin（n ＝9）

2.3 出膏率測定

取定容后的煎液100 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，放入烘箱，105 ℃烘干6 h 以上，并記錄第1 次浸膏質(zhì)量；繼續(xù)烘干1 h，記錄第2 次浸膏質(zhì)量；繼續(xù)烘干1 h，記錄第3 次浸膏質(zhì)量，取3 次的均值。按出膏率＝［干膏質(zhì)量／飲片質(zhì)量］×100%計算淫羊藿出膏率。結(jié)果15 批淫羊藿 出 膏 率 為 14.80% ～21.80% ，平 均 出 膏 率 為17.14% ，RSD 為 1.71% （ n ＝ 3）。詳見表 3。

2.4 轉(zhuǎn)移率測定

按轉(zhuǎn)移率（%）＝W／ M×100%計算淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率，其中，W 為湯劑中淫羊藿苷的含量（%），M 為飲片中淫羊藿苷的含量（%）。由表3 可知，15 批淫羊藿標(biāo)準(zhǔn)湯劑中淫羊藿苷含量介于0.26% ～0.64%，轉(zhuǎn)移率介于 51.05% ～60.49% ，平均轉(zhuǎn)移率為 55.30% ，RSD為 3.15% （ n ＝ 15）。

表3 淫羊藿出膏率與淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果Tab.3 Determination results of the extract rate of Epimedium brevicornum and the transfer rate of icariin

2.5 特征指紋圖譜分析

指紋圖譜的相對性反映中藥的化學(xué)成分及其量的分布狀況，專屬性較強(qiáng)，特征較明顯，信息量豐富，是一種可同時分析中藥多組分、多指標(biāo)成分的方法［18］。分別吸取15 批供試品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰，生成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜見圖2?？梢?，標(biāo)定共有峰7 個，通過對照品指認(rèn)5 個峰，分別為1 號峰，朝藿定 A（Rt ＝ 8.661 min）；2 號峰，朝藿定 B（Rt ＝10.022 min）；3 號峰，朝藿定 C（Rt ＝11.334 min）；4 號峰，寶藿苷Ⅰ（Rt ＝ 13.067 min）；5 號峰，淫羊藿苷（Rt ＝ 15.607 min）。15 批淫羊藿標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度為 0.95。

圖2 淫羊藿標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜1.Epinedin A 2.Epinedin B 3.Epinedin C 4.Pogoside Ⅰ 5.IcariinFig.2 Fingerprint of standard decoction of Epimedium brevicornum

3 討論

本研究中采集了15 批淫羊藿飲片，其產(chǎn)地為陜西、山西、甘肅、遼寧、東北，基本覆蓋淫羊藿的主產(chǎn)區(qū)，具有代表性，符合《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》中關(guān)于原料樣品的規(guī)定。另外，根據(jù)2020 年版《中國藥典（一部）》相關(guān)規(guī)定，對15 批淫羊藿飲片進(jìn)行檢查，結(jié)果所有飲片均符合要求。試驗中采用趁熱濾過的方式進(jìn)行分離，以減少成分的損失，趁熱濾過后濾液放置冷水中迅速冷卻，抑制成分降解，契合傳統(tǒng)湯劑工藝。根據(jù)藥典規(guī)定，含量測定時流動相選用乙腈－水溶液，結(jié)果色譜峰峰形較好，目標(biāo)峰分離度較好。