楊 俐 趙素萍

（云南省大理市植保植檢站,云南 大理 671000）

藍莓(Blueberry)又名越橘，杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬（Vaccinium）植物，為多年生落葉或常綠灌木類果樹。藍莓野生種在我國廣泛分布，常見于海拔400-1400m的山林或灌木叢中，是酸性紅埌土的指示植物。大理周圍山林地也有分布，但品質(zhì)與引進的栽培品種相比較差，無市場價值。藍莓果實中含有豐富的鞣花酸和花青素類物質(zhì)，以及具有低糖，低脂肪和強抗氧化能力等特點，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織重點推薦的人類五大健康食品之一，被譽為世界水果之王。是最近幾年世界發(fā)展最為迅速的集營養(yǎng)保健于一身的第三代果樹新品種。目前植物組織培養(yǎng)以及扦插技術(shù)廣泛應(yīng)用于藍莓的繁殖栽培。近三十多年來世界各國在藍莓組織培養(yǎng)的技術(shù)上已有深入的進展。我國劉慶忠等在藍莓組織培養(yǎng)工作中最早開展研究工作，取得了很好的成績。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)于1983年率先在我國開展了藍莓引種栽培工作，另外山東果樹所，南京農(nóng)科院，大連理工大學(xué)先后從國外引進二百多個品種，同時開展了藍莓繁育技術(shù)的研究。目前組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)已成為各地藍莓苗繁育的主要途徑，各地使用的培養(yǎng)基配方也很多，技術(shù)效果各不相同。我們采用了目前我國通用的WPM改良配方，同時自己也設(shè)計了WM配方，并對兩者進行了比較研究。

1.材料和方法

1.1 外植體

試驗用藍莓品種由大理市藍莓種植合作社提供。分為休眠枝與萌發(fā)枝兩種類型。休眠枝來自2012年冬季11.12月及2013年2月。萌發(fā)枝來自2013年3-8月。以高灌品種密斯提(Misty)(薄霧)為主，夏普藍(Sharpblue)及兔眼品種燦爛(Bright well)為輔為對比。在田間選取一年生健壯枝條帶回實驗室。切除葉片和頂部花芽，留取下部約10個腋芽的莖段作為外植體。在流水下洗去灰塵后浸泡在含有洗衣粉的水中清洗二次，然后流水沖洗1h?？馗伤趾笾贸瑑艄ぷ髋_中，先用較干的75%酒精棉球擦去表面水分，用無菌剪刀剪成5cm段置無菌燒杯內(nèi)，加入75%酒精浸1min，無菌水沖洗一次，加入0.1%升汞10mim，水洗5次，切成0.5-1cm小莖段，每段帶1個腋芽接種。用50ml三角瓶，每瓶接1個莖段，也有用培養(yǎng)瓶接3個莖段。25℃±2℃2000lx16h/d。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及激素配比

本實驗所用培養(yǎng)基有二種。一是通用的WPM改良培養(yǎng)基，另一種是自己設(shè)計的WM培養(yǎng)基。分別稱為A(WPM)及B(WM)培養(yǎng)基。休眠芽初代分化培養(yǎng)激素配比設(shè)六個組合，A、B兩種培養(yǎng)基相同。繼代增殖培養(yǎng)設(shè)三種組合，A、B相同。萌發(fā)枝初代分化培養(yǎng)只用B培養(yǎng)基，設(shè)六個組合。繼代增殖培養(yǎng)也只用B培養(yǎng)基設(shè)四個組合。壯苗培養(yǎng)基為B+ZT0.1+IBA0.1mg/L；在生根培養(yǎng)前也可經(jīng)由B+ZT0.5+IBA0.1mg/L繼代苗轉(zhuǎn)入。生根培養(yǎng)為三個組合。

1.2.2 休眠芽的初始分化培養(yǎng)

表1 同一培養(yǎng)基不同激素配比對幼苗分化的比較，品種：薄霧(misty)，培養(yǎng)天數(shù)50天。

B2.3 0 2 0 0.1 30 13 43.3有愈傷組織

由表一可以看出，休眠芽萌發(fā)率普遍不高。最高者為43%（B2.3），最低著26.6%（A1.2、A1.3、B1.2）。在各激素對比中，ZT2mg/L萌發(fā)率最高43.3%及40%，ZT1+BA1mg/L和ZT1mg/L，次之(36.6%和33.3%)，而BA較低(33.3%，30%及26.6%)。但是萌發(fā)率最高的ZT2mg/L有少量愈傷組織產(chǎn)生，多在莖段基部。如果以葉片為外植體，在葉片切口處及葉柄斷口處產(chǎn)生許多綠色愈傷組織。就A與B兩培養(yǎng)基相比，B培養(yǎng)基的幼苗葉色較綠，葉片也較寬。

表二 不同品種之間在初始培養(yǎng)中分化率的比較，培養(yǎng)天數(shù)50天品種：夏普藍(Sha rpblue)、薄霧(misty)及兔眼(Brightwell)

以上三個品種通過比較,以2號品種薄霧的萌發(fā)率較高，夏普藍居中，燦爛較低。

1.2.3 休眠芽幼芽的繼代增殖培養(yǎng)

表三 薄霧在不同激素配比的繼代培養(yǎng)中增值效果的比較，培養(yǎng)天數(shù)50天

通過二種激素含量對比，50天培養(yǎng)后，平均增殖幼苗數(shù)分別為5.5個和6.1個。苗高度最高7.2cm，平均4.5cm與4.3cm。增殖率5倍以上。但ZT2mg/L的幼苗葉片較小，葉色發(fā)紅，可能是與非極性物質(zhì)及色素大分子的積累有關(guān)。ZT2mg/L在莖段基部有時會有少量愈傷組織產(chǎn)生。通過降低ZT含量(下降至0.1mg/L)并加入1g/L活性炭可使其恢復(fù)正常生長。

1.2.4 萌發(fā)枝的初始分化培養(yǎng)

經(jīng)過第一階段對休眠枝初始分化及繼代培養(yǎng)的觀察比較，在萌發(fā)枝的組織培養(yǎng)中選用薄霧品種為研究對象，進一步的比較觀察，為今后大批量生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

表四 相同培養(yǎng)基（A及B）中，不同激素對初始分化效果的比較，品種：薄霧、培養(yǎng)天數(shù)30天

通過上表可以看出，萌發(fā)枝經(jīng)過培養(yǎng)后，幼芽萌發(fā)率比休眠芽明顯提高，最高可達80%分，最低也達56.6%，B2.3的ZT含量2mg/L，雖然萌發(fā)率高(80%)，但有些莖段基部會產(chǎn)生愈傷組織，而B2.2萌發(fā)率僅次于B2.3，基本不產(chǎn)生愈傷組織，而ZT用量減少了一半(ZT1mg/L)。經(jīng)過對A及B兩種培養(yǎng)基的生長情況比較，B培養(yǎng)基葉較寬大，葉色也較綠，為下步繼代培養(yǎng)提供了參考。

1.2.5 萌發(fā)枝的繼代增殖培養(yǎng)

表五 B培養(yǎng)基，不同激素配比對薄霧增殖效果的比較，培養(yǎng)天數(shù)50天

通過以上激素對比，可以看到B2.2效果最好，幼苗分枝數(shù)、高度、葉色均較好，而TDZ組合，以TDZ0.02mg/L較合適，TDZ0.05mg/L幼苗基部生長較多愈傷組織，苗也不高，分枝也較少。

值得注意的是本次實驗結(jié)果的增殖率不高。原因是在5月底、6-7月大理天氣炎熱，培養(yǎng)室無制冷空調(diào)，室溫常達28℃以上，最高31℃，使幼苗生長受到抑制，葉色開始變淡，甚至發(fā)黃。8月下旬起，氣溫逐漸下降，生長有所恢復(fù)，至9月后室溫在27℃以下，生長才轉(zhuǎn)入正常。整體看，與其他作物相比，增殖率不高，苗也不高，效果不理想。

1.2.6 生根培養(yǎng)

對休眠枝和萌發(fā)枝的繼代幼苗進行了生根培養(yǎng)，幼苗來自不同細胞分裂素含量，其生根效果不同。

表六 由繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)時不同細胞分裂素含量對生根效果的比較，品種：薄霧、培養(yǎng)時間50天生根培養(yǎng)基：1/2 B+IBA0.6mg/L+活性炭1g/L

由上表可以看出，從繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)時，必須減少細胞分裂素的含量，否則不生根，只有莖的基部略膨大，有少量根原基產(chǎn)生。如通過壯苗培養(yǎng)，生根效果較好，在壯苗培養(yǎng)基中ZT為0.1mg/L含量很低，苗生長慢，比ZT0.5mg/L要差些，但生根效果比ZT0.5mg/L要好。

在生根培養(yǎng)基篩選方面，做了三個組合，結(jié)果如下：

表七 不同生長素含量對薄霧生根率的比較，培養(yǎng)時間50天

通過生長素含量對比，以IBA0.6mg/L較為合適。IBA濃度為1mg/L時，根少而粗短，含量低，則根纖細而多。

1.2.7 瓶外生根

材料選自經(jīng)過壯苗培養(yǎng)或生根培養(yǎng)未生根的幼苗。將幼苗取出，在水中(加入800倍多菌靈)洗去培養(yǎng)基，在生根液中浸蘸。使用兩種濃度，一種是NAA1000mg+IBA1000mg/L，這種濃度采用速蘸一下；另一種IBA100mg/L浸泡30min。所用基質(zhì)為消毒后的水苔經(jīng)800倍多菌靈浸泡12h，然后擠干水分后平鋪在塑料筐內(nèi)，厚7cm。將小苗用鑷子扦插在苔蘚苗床上。扦插后外邊罩上一層塑料農(nóng)膜保濕。7天內(nèi)保濕度95%，20-28℃，放在培養(yǎng)室背光處(防陽光直射)；第二周保濕度85%；20天后逐漸揭去薄膜增加透氣。生根后每周噴1/2大量元素與0.1%Feso4交換噴施，逐漸改成0.2%硫酸銨及0.2%Feso4二周澆施一次。90天后可移栽至直徑15cm的營養(yǎng)缽內(nèi)，基質(zhì)為草炭土+松針腐葉土+沙壤紅土(1:1:1)。

2.討論

2.1 藍莓休眠芽的初代培養(yǎng)與萌動芽相比，萌發(fā)率偏低。如通過一段室內(nèi)水培過程，可以提高芽的萌發(fā)率。具體做法是將休眠枝條按常規(guī)清洗好后，浸入稀新潔爾滅液中15min，蒸餾水洗二次。然后插入蒸餾水中深約3-5cm。在培養(yǎng)室全光照，25℃，每天換水，使休眠芽萌動后再消毒接種。

2.2 藍莓培養(yǎng)過程中，污染現(xiàn)象嚴重，初次消毒曾增加生汞含量為0.15%，消毒10min，或升汞0.1%增加消毒時間為15min。這兩種方法對芽的傷害較大，影響發(fā)芽率。另一方面，在培養(yǎng)30天以后，有不少培養(yǎng)瓶內(nèi)莖段基部出現(xiàn)細菌性污染，真菌性較少。這些細菌是否為莖內(nèi)已存在的內(nèi)生菌，也不清楚。我們在培養(yǎng)基中加入青霉素，結(jié)晶紫，效果不明顯。

2.3 在培養(yǎng)過程中，幼苗葉片產(chǎn)生紅或紫紅色，或葉色變淡，發(fā)黃，發(fā)白，甚至玻璃化等現(xiàn)象。這些情況多發(fā)生在培養(yǎng)室內(nèi)溫度超過28℃，瓶蓋為塑料蓋，瓶內(nèi)透氣不良，出現(xiàn)水漬狀，光照不足等。經(jīng)過室內(nèi)溫度調(diào)整，改用透氣膜瓶蓋，對培養(yǎng)基組分含量進行調(diào)整，保證16h/d光照，加入0.5-1g/L活性炭等措施，這些情況有所改善。

2.4 在藍莓初代分化培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)中，均使用不同含量和種類的細胞分裂素，進行比較。我們認為ZT效果比BA略好一些，但ZT價格昂貴，使用量也大，而BA價格低廉，且耐高壓消毒，幼苗的質(zhì)量也好，所以用BA代替ZT完全可以完成初代分化及繼代增殖的培養(yǎng)，可以大大降低成本。我們也使用了TDZ代替ZT，使用濃度為0.02mg/L，是ZT含量的50-100分之一。雖然TDZ價格貴，但因使用濃度極低，其成本價與BA相近。而且培養(yǎng)的幼苗生長狀況也較好。所以TDZ也是代替ZT的理想細胞分裂素。

2.5 作者自己設(shè)計了WM培養(yǎng)基，在藍莓的初代，繼代培養(yǎng)中表現(xiàn)出幼苗葉片比WPM改良培養(yǎng)基略寬大，葉色也較綠，效果勝似WPM。